LC-ESI-MS/MS法测定草棉花瓣提取物中组氨酸的含量

赛力曼·哈得尔，艾则孜·莫合买提（1.新疆医科大学第一附属医院药剂科，乌鲁木齐市 830054；2.新疆食品药品检验所，乌鲁木齐市 830000）

草棉[1]，又名小棉、非洲棉，属锦葵科，是新疆主要栽培棉种，资源十分丰富。草棉花瓣提取物含有组氨酸，是一种非必需氨基酸，由于其侧链中含有氨基，具有碱性，故属于碱性氨基酸。同其他氨基酸一样，它是蛋白质结构的组成部分，参与动物机体中蛋白质的合成，同时还以多种形式广泛参与机体的各种生理生化过程，并具有抗老年痴呆和抗血栓的作用，目前在临床上用于治疗心脏病、贫血、风湿性关节炎等疾病。但是，组氨酸在人体内易转化为组胺，造成人体内组胺蓄积，诱发头晕、头痛、心慌等不适症状，故需对其含量进行测定与控制。

组氨酸结构中存在羟基、羧基、氨基等基团，需要进行复杂的衍生化才能用高效液相色谱（HPLC）法[2]测定。近年来，串联质谱（MS/MS）法得到了快速发展，它弥补了传统HPLC的缺点，三重四极杆质谱作为其中的代表被广泛用于低浓度药物含量的研究领域。液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）法[3]检测无需进行衍生化便可直接测定，故笔者建立了以LC-ESI-MS/MS法测定草棉花瓣提取物中组氨酸含量的方法。本方法准确、灵敏度高、重复性好，可用于草棉花瓣提取物的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1200 Series HPLC仪，包括G1322A真空在线脱气机、G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1316A程温箱、G1315 DAD检测器（美国安捷伦科技有限公司）；QTRAP LCMS/MS三重四极杆MS/MS仪，配备电喷雾离子源（ESI）、Analyst 1.4.2工作站（美国Applied Biosystems公司）；AG-135型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Gilson精密移液器（北京吉尔森科技有限公司）。

组氨酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号:624-200104）；草棉花瓣提取物由中国科学院新疆理化技术研究所提供并鉴定；甲醇、甲酸均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取组氨酸对照品0.01027 g，置于10mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，再取1.0mL置于10mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，得组氨酸浓度为102.7μg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液 精密称取草棉花瓣提取物粉末（过三号筛）约0.20 g，置10.0mL量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.2 分析条件

2.2.1 LC条件 色谱柱:Altima HP HILIC（150mm×2.1mm×3.0 μm）；流动相:甲醇-0.1%甲酸溶液（10∶90）；流速:0.20mL·min-1；柱温:室温。

2.2.2 MS条件 离子源:ESI；正离子扫描方式；离子喷射电压（IS）:5500 V；离子源温度（TEM）:380℃；雾化气1（GS1）压力:65 psi；干燥气2（GS2）压力:60 psi；气帘气（CUR）压力:25 psi；检测方式:多反应离子监测模式（MRM）；碰撞能量（CE）:19 V；去簇电压（DP）:55 V；用于定量分析的离子反应为:m/z 156.4→m/z 110.1。MS与HPLC图分别见图1、图2。

图1 质谱图A.组氨酸的MS图；B.组氨酸[M+H]（+m/z 156）的二级MS图Fig 1 Mass chromatogramsA.MS chrometograms of histidine；B.MS2of[M+H]+（m/z 156）of histidine

图2 组氨酸MRM检测获得的色谱图A.组氨酸对照品；B.样品（批号:20050303）Fig 2 Chromatograms of histidine detected with MRMA.histidine control；B.sample（lot num:20050303）

2.3 线性关系考察

精密吸取上述组氨酸对照品溶液适量，用流动相分别稀释成浓度为0.05135、0.10270、0.20540、0.30810、0.41080、0.51350、0.61620μg·mL-1的系列对照品溶液。取10μL进样，测定峰面积。以在MRM下选择离子的峰面积积分值（Y）对其浓度（X，μg·mL-1）进行线性回归，得回归方程为Y＝576613X－4482（r＝0.9995，n＝7）。结果表明，组氨酸检测浓度在0.05135～0.61620μg·mL-1范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 检测限和定量限测定

取对照品溶液适量，用流动相依次稀释制成一系列由高到低梯度浓度的溶液，在上述色谱条件下分别进样，取MS峰面积为信噪声3倍（S/N＝3）计算检测限为1.65 ng·mL-1，10倍（S/N＝10）计算定量限为10.27 ng·mL-1。

2.5 精密度试验

精密吸取上述组氨酸对照品溶液适量，连续进样5次，测定峰面积。结果，RSD＝0.9%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批样品（批号:20050303）适量，共6份，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，计算含量。结果，样品中组氨酸的平均含量为0.050%，RSD＝1.6%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一批（批号:20050303）供试品溶液适量，分别于0、3、6、12、18、24h测定组氨酸的峰面积。结果，RSD＝1.3%（n＝6），表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的样品约0.20 g，共9份，精密称定，每3份为一组，分别精密加入对照品溶液1.0、3.0、5.0μL，用流动相定容至10mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样10μL，按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果，平均回收率为99.8%，RSD＝1.5%（n＝9）。加样回收率试验结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 样品含量测定

取3批样品各适量，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，在上述色谱条件下进样测定。结果，3批样品（批号:20070604、20050303、20050428）中组氨酸的含量分别为0.051%、0.053%、0.042%，RSD分别为1.7%、0.9%、1.6%。

3 讨论

本试验采用LC-ESI-MS/MS法测定草棉花瓣提取物中组氨酸含量，样品无需衍生化可直接进样分析，不需要烦琐的前处理，减少了测定误差，结果可靠。

氨基酸的ESI-MS分析既可采用正离子模式也可使用负离子检测。组氨酸采用正离子模式分析，以[M+H]+（m/z 156）作为母离子进行二级MS裂解，主要产生m/z142.4、110.1等特征离子，MRM选择母离子m/z156.4和子离子110.1测定。

在对流动相的选择上，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等流动相。结果表明，加入甲酸对组氨酸灵敏度影响较大，最终选择了甲醇-0.1%甲酸溶液。

[1]新疆维吾尔自治区卫生厅编.维吾尔药材标准（上册）[S].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1993:357.

[2]鄢 丹，李 果，等.反相高效液相色谱法直接测定水蛭中14种未衍生氨基酸的含量[J].分析化学，2006，34（5）:705.

[3]刘 影，贺玖明，陈艳华，等.无需母离子选择可获得二级质谱的RRLC-MS/MS方法研究[J].质谱学报，2007，28（增刊）:6.