丹参抑制人粘连成纤维细胞增殖的作用研究Δ

曾煦欣，王芳，蒋泓，邝嘉乐（.佛山科学技术学院医学院药学实验室，佛山市 528000；2.广东药学院中药学院中药药剂系，广州市 50006）

腹部手术后粘连（术后粘连）是腹膜受到手术损伤与刺激后，脏器之间、脏器与腹壁之间产生的纤维性粘连，发生率达90%以上，常导致腹部慢性疼痛和女性不孕，严重者可发展为肠梗阻甚至死亡[1]。研究显示，丹参可通过抑制胶原生成、促进胶原降解预防术后粘连生成，但具体机制尚未明确，影响其进一步推广应用[2]。在粘连形成过程中，成纤维细胞的增殖与胶原合成是主要因素[3]，因此该细胞很可能是丹参防治术后粘连的作用靶点。为证实这一推测，本研究利用MTT法与Real-time PCR法考察丹参及其主要成分对成纤维细胞增殖的影响，对该药防治术后粘连的具体机制与物质基础进行探讨。

1 仪器与试药

1.1 仪器

细胞培养板、培养皿与培养瓶（美国Cornig公司）；E045型CO2培养箱（德国Binder公司）；超净台（苏州安泰空气技术有限公司）；DM-IRB型倒置显微镜（德国Leica公司）；3K18型台式低温冷冻离心机（美国Sigma公司）；680型酶标仪、MiniOpticon型Real time PCR仪（美国Bio-Rad公司）；TGRADIENT型PCR仪（德国Biometra公司）。

1.2 试药

丹参冻干粉（南方医院药学部提供，丹参素含量8%～15%，批号:20070630）；丹参素钠对照品（批号:110781-20091）、丹参酮ⅡA磺酸钠对照品（批号:111605-200301）由中国药品生物制品检定所提供；地塞米松注射剂（成都天台山制药有限公司，批号:080202）；DMEM高糖培养基（吉诺生物医药技术有限公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；0.25%胰酶（美国Gibco公司）；MTT（美国Sigma公司）；二甲基亚砜（分析纯，天津大茂化学试剂厂）；RNAprep试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）；RT试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM（大连宝生物工程有限公司）。

2 方法与结果

2.1 粘连成纤维细胞（AFB）的体外培养

取人体粘连组织，按照文献方法[4]进行AFB的原代培养，取第3～5代细胞进行试验。细胞培养条件:含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，温度37℃，CO2浓度5%，相对湿度95%。

2.2 丹参对AFB增殖活性的影响

按照文献方法[2]，将AFB接种于96孔板，经贴壁、同步化处理后，各孔分为丹参冻干粉（Dashen Powder，DSP）、丹参素（Danshensu，DSS）、丹参酮ⅡA（Danshinone ⅡA，DⅡA）和地塞米松（Dexamethasone，DEX）组，每组均设8个浓度，分别为0、2.5、5、10、20、40、80、160μg·mL-1，每一浓度均设6个平行孔，培养48 h后按MTT法测定各孔吸光度。使用公式（1）计算各孔的AFB活性（Viability），公式（2）计算药物对AFB的抑制率（Inhibition rate，IR），采用SPSS 12.0中的Probit回归进行剂量-抑制率关系分析，求出丹参和地塞米松对AFB的半数抑制浓度（IC50）。

结果表明，随着剂量增加，AFB活性下降幅度最大的是DSP组，DSS组次之，随后依次为DEX组与DⅡA组；IC50由低到高依次为DSS组、DSP组、DEX组、DⅡA组。使用统计软件SPSS12.0进行One-way ANOVA检验，结果显示各组IC50均存在显著性差异（P＜0.01）。药物对AFB增殖的IC50测定结果见表1；药物作用48 h后AFB的活性见图1。

表1 药物对AFB增殖的IC50测定结果（n＝3）Tab 1 Results of IC50of drug against the proliferation of AFB（n＝3）

图1 药物作用48 h后AFB的活性（%，n＝4）Fig 1 Activity of AFB after treated with drug for 48 h（%，n＝4）

2.3 丹参对AFB TGF-β1mRNA表达水平的影响

将AFB接种于Ø6cm培养皿，每皿细胞数1×106个，经贴壁、同步化处理后，分为DSP、DSS、DⅡA和DEX组，每组均设3个药物处理浓度，分别为2.5、10、40μg·mL-1，同时设空白对照组（Control），每组均设3个平行试验。各组均使用含10%胎牛血清DMEM培养液，终体积均为5mL。培养48 h后，按试剂盒说明书提取总RNA，逆转录为cDNA后置－20℃下冻存，待用。根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的人体mRNA序列，用Prime Premier软件设计内参β-actin与目的基因转化生长因子（TGF）-β1的引物，由上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen）合成。按照SYBR®Premix Ex TaqTM中的25μL体系进行Real time PCR检测，反应条件:95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，40个循环。记录周期阈值（CT值），采用文献的2-ΔΔCT法，按公式（3）计算各个药物组相对于空白对照组的TGF-β1mRNA表达倍数F:

Real-time PCR检测结果表明，使用统计软件SPSS12.0进行One-way ANOVA检验，结果显示DSP、DSS各剂量组以及DEX高剂量组（40μg·mL-1）的TGF-β1mRNA水平均与空白对照组（F＝1.00）存在显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）；而且DSP与DSS组的TGF-β1mRNA水平随着剂量增加而下降，各剂量组之间存在显著性差异（P＜0.01），呈现一定剂量依赖关系。Real-time PCR检测用引物序列见表2；TGF-β1mRNA表达结果见表3。

表2 Real-time PCR检测用引物序列Tab 2 Primer sequence of Real-time PCR

表3 TGF-β1mRNA表达结果（n＝3）Tab 3 Result of TGF-β1mRNAexpression（n＝3）

3 讨论

传统中医对术后粘连主张使用活血化瘀、补气理气的治则。丹参具有活血行血和化瘀滞的功效，因而被大量经方、验方与中药制剂采用；同时大量研究也证实丹参具有抗纤维化、改善血液微循环与抗炎的药理作用，与现代医学粘连防治策略相符[2，5]。故无论从中医角度还是从西医角度出发，丹参均是粘连防治的理想药物，前景广阔。近年的研究表明，成纤维细胞在腹膜损伤部位的迁移和增殖是术后粘连形成的关键。更有文献提出今后粘连研究方向应该集中到探讨成纤维细胞、间皮细胞、内皮细胞在粘连部位的特性与行为，以及它们与胞外微环境的相互联系上[3]。文献显示，抑制胶原生成、促进胶原降解、抑制促纤维化细胞因子表达是丹参预防术后粘连生成的机制[3]，而损伤腹膜处成纤维细胞分泌合成胶原是引起沉积的纤维蛋白机化的主要原因[2，6]。笔者据此推断AFB可能是丹参防治粘连的主要作用靶点，故从人体粘连组织中培养出AFB，用于丹参粘连防治机制的研究。

研究结果表明，DSP、DSS作用下AFB活性的下降幅度要高于DⅡA与DEX，而且IC50也显著低于DⅡA与DEX（P＜0.01），说明丹参可抑制AFB的增殖，而且水溶性成分DSS的作用强于脂溶性成分DⅡA和阳性对照药DEX；同时，DSP与DSS均能使AFB的TGF-β1mRNA水平下调，并呈一定剂量依赖关系，DⅡA、DEX对TGF-β1mRNA水平影响则不大，进一步说明丹参通过下调AFB的TGF-β1mRNA水平来抑制AFB增殖，而且主要起效成分为水溶性的DSS。上述结果初步证实了笔者的设想，揭示了丹参抑制AFB过度增殖防治粘连的机制，为下一步从分子水平探讨丹参的作用机制打下了基础。

[1]Schnüriger B，Barmparas G，Branco BC，et al.Prevention of postoperative peritoneal adhesions:a review of the literature[J].Am J Surg，2011，201（1）:111.

[2]邝婉容，曾煦欣，杨安平，等.丹参防治术后粘连的研究进展[J].中国民族民间医药，2009，18（6）:17.

[3]Boland GM，Weigel RJ.Formation and prevention of postoperative abdominal adhesions[J].J Surg Res，2006，132（1）:3.

[4]曾煦欣，王春霞，王 芳，等.维通注射剂对大鼠腹膜正常与粘连成纤维细胞增殖活性与细胞周期的影响[J].中国新药杂志，2011，20（3）:48.

[5]杨西晓，曾煦欣，侯连兵.常通口服液对手术所致肠粘连大鼠肠壁转化生长因子表达的影响[J].中国药房，2004，15（4）:206.

[6]Cheong YC，Laird SM，Li TC，et al.Peritoneal healing and adhesion formation/reformation[J].Hum Reprod Update，2001，7（6）:556.