蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎的改善作用研究Δ

林广庆，严鹏科，罗其富，谢金魁（1.广州医学院第三附属医院药剂科，广州市 510150；.南华大学药理研究所，衡阳市 41000）

蛞蝓（Limax）为有肺的软体动物，属腹足类腹足纲蛞蝓科，我国各地有产。因其体表布满黏液，形似蜗牛而无壳，故又俗称“黏虫”、“鼻涕虫”。作为传统中药，蛞蝓“味咸寒，入肺、肝、大肠经。无毒”。功能“清热祛风，消肿解毒，破瘀通经”。主治中风、筋脉拘挛、惊痫、喘息、喉痹、咽肿、痈肿、丹毒、经闭、症瘕、蜈蚣咬伤等证。

蛞蝓冻干粉是以广西百色地区出产的足襞蛞蝓新鲜全虫，经匀浆、冻干后制备的胶囊剂，属中药2类新药。本文旨在按《中药新药研究指南》和《药物研究技术指导原则》开展蛞蝓冻干粉治疗慢性支气管炎的临床前药效学研究，探讨蛞蝓冻干粉在镇咳、化痰和平喘方面的作用，为临床应用其治疗慢性支气管炎等肺系疾病提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CH型显微镜摄影系统（日本Olympus公司）；FA1004型电子天平（上海天平仪器厂）；1512型切片机（德国Leica公司）；402A1型超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司）；UV-160A型分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试药

蛞蝓冻干粉（南华大学药物药理研究所，批号:20050012）；地塞米松（批号:091107）、右美沙芬（批号:091027）均由武汉远成药业有限公司提供；氯化乙酰胆碱（上海国药集团化学试剂有限公司，批号:040910）；氯化铵（北京制药厂，批号:021018）；苯酚红（批号:980820）、碳酸氢钠（批号:031012）均购自北京化工厂；磷酸组胺、脂多糖（LPS）、氨茶碱、二氧化硫（SO2）均购自北京利科药物公司。

1.3 动物

昆明种小鼠，♀♂兼半，体重18～22 g；SD大白鼠，♀♂兼半，体重150～200 g，由湖南农业大学动物科技学院实验动物中心提供（动物合格证号:SCXK（湘）2003-0003）。动物置于符合中国实验动物质量国家清洁级标准的实验室中饲养，室温20～25℃，相对湿度55%～70%。鼠用全价颗粒饲料由湖南农业大学动物科技学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 给药剂量的设定

原料样品为淡黄色粉末，气微腥，味微苦腥。实验时药物用0.9%生理盐水溶液配制，置冰箱中贮藏，临用时摇匀。

预期人临床日用量为700mg，实验动物的高剂量按体重折算为成人临床日用量的3倍，高、中、低剂量以3为等比递减。小鼠高、中、低剂量分别为300、100、33mg·kg-1，给药浓度分别为30、10、3.3 g·L-1，给药体积为10mL·kg-1。大鼠高、中、低剂量分别为210、70、23mg·kg-1，给药浓度分别为21、7、2.3 g·L-1，给药体积为10mL·kg-1。

2.2 慢性支气管炎模型的SO2刺激实验[1，2]

取18～22 g小白鼠90只，♀♂兼用。按随机分组法分为6组，即正常对照、模型对照、地塞米松和蛞蝓冻干粉高、中、低剂量组。正常对照组不给予SO2刺激，正常饲养；其余5组每天进行SO2刺激，以复制慢性支气管炎小鼠模型。

取一个8 L的玻璃钟罩，在其中放一个蒸发皿，蒸发皿中加入0.5 g无水亚硫酸钠，将小鼠放入钟罩内，向蒸发皿中迅速加入50%硫酸5mL后立即加盖，刺激2min后取出，每天1次，持续21 d。

SO2刺激21 d后，正常对照和模型对照组ig生理盐水15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松组ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d，并从第8天开始同时ig右美沙芬15mg·kg-1，每天1次，共3 d；蛞蝓冻干粉高、中、低剂量组分别ig蛞蝓冻干粉300、100、33mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期间观察各组小鼠的整体情况，并在末次给药1 h后，给予SO2刺激，观察并记录每只小鼠的咳嗽潜伏期和在3min内咳嗽次数。用药组小鼠咳嗽潜伏期和咳嗽次数与模型对照组进行比较，并作组间t检验。

2.3 慢性支气管炎模型的气管段酚红实验[1]

分组与复制模型同“2.2”项下方法。

SO2刺激21 d后，正常对照和模型对照组ig生理盐水15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松组ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d，并从第8天开始同时ig1.2%的氯化铵溶液，每只0.5mL，每天1次，共3 d；蛞蝓冻干粉高、中、低剂量组分别ig蛞蝓冻干粉300、100、33mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期间观察各组小鼠的整体情况，并在末次给药0.5 h后，ip1%生理盐水苯酚红溶液，每只0.5mL，再过0.5 h脱臼处死小鼠，将小鼠固定于手术台，剪开颈部正中皮肤，小心剔除气管周围组织，剪下环状软骨至气管分支处的一段气管，放入5%碳酸氢钠溶液中，并进行气管内灌洗，来回3次，静置，第2天进行吸光度（OD）值的测定（用分光光度计在546 nm波长处测定OD值，用酚红作一标准曲线，根据曲线计算出酚红含量）。

2.4 慢性支气管炎模型的喷雾致喘实验[1，3]

取150～200 g健康SD大鼠，♀♂兼用。实验前预选大鼠，预选方法:取引喘液（4%磷酸组胺加2%氯化乙酰胆碱）10mL注入超声雾化仪，开启雾化仪，喷雾1min，测定引喘潜伏期（喷雾开始至抽搐跌倒的时间），超过10min无反应者弃去。选出75只动物，按随机分组的方法分为5组，即模型对照、地塞米松和蛞蝓冻干粉高、中、低剂量组，每组15只，复制慢性支气管炎模型。

用10%水合氯醛溶液，以3mL·kg-1的剂量ip麻醉大鼠。将麻醉后的大鼠固定于手术台，拉出舌体，暴露声门，用长约8cm、直径0.1cm的聚乙烯管作气管导管，快速将气管导管插入气管，蘸取少量清水涂于管口，水柱随大鼠呼吸上下移动，说明确实已插入气管，将200µg（200µL）LPS注入气管内，饲养21 d。

复制模型21 d后，模型对照组ig生理盐水溶液15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松组ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d，并从第8天开始同时ig氨茶碱100mg·kg-1；蛞蝓冻干粉高、中、低剂量组分别ig蛞蝓冻干粉210、70、23mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期间观察各组大鼠的整体情况，并在末次给药1 h后，按预选实验同等条件和方法再次测定引喘潜伏期，记录实验结果并作组间t检验。

2.5 慢性支气管炎模型的病理组织观察

预选大鼠、分组与复制模型方法同“2.4”项下方法。

复制模型21 d后，模型对照组ig生理盐水溶液15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松组ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d；蛞蝓冻干粉高、中、低剂量组分别ig蛞蝓冻干粉210、70、23mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期间观察各组大鼠的整体情况，10 d后将大鼠ip10%水合氯醛溶液4mL·kg-1麻醉，将麻醉后的大鼠固定于手术台，打开颈部、胸腔，取气管及肺组织，观察大体标本的情况，然后用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片并行HE染色，显微镜观察肺组织支气管的炎性病变程度，包括上皮的完整性、腺体的厚度、黏膜下炎性细胞浸润情况、淋巴滤泡，以及气管壁的厚度和腺体层厚度。

2.6 统计学方法

统计学分析用Student t检验，P＜0.05表示有统计学意义。数据处理软件为SPSS 13.0统计学软件。

3 结果

3.1 蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型小鼠的止咳作用

蛞蝓冻干粉高、中剂量组咳嗽次数与模型对照组比较显著降低（P＜0.05），咳嗽潜伏期也显著缩短（P＜0.05）。蛞蝓冻干粉低剂量组咳嗽潜伏期有增加的趋势，但无显著性差异。蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型小鼠的止咳作用见表1。

3.2 蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型小鼠的祛痰作用

蛞蝓冻干粉高、中剂量组的气管段酚红含量显著高于模型对照组（P＜0.05），高剂量组的酚红含量与阳性对照药地塞米松+氯化铵（1.2%）疗效相当。蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型小鼠的祛痰作用见表2。

表1 蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型小鼠的止咳作用（n＝15）Tab 1 Cough-relieving effect of Limax lyophilized powder on mice models of chronic bronchitis（n＝15）

表2 蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型小鼠的祛痰作用（n＝15）Tab 2 Effect of Limax lyophilized powder on expectorant in mice models of chronic bronchitis（n＝15）

3.3 蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型大鼠的平喘作用

蛞蝓冻干粉高、中剂量组与模型组比较，引喘潜伏期均显著延长（P＜0.05）。蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型大鼠的平喘作用见表3。

表3 蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型大鼠的平喘作用（n＝15）Tab 3 Effect of Limax lyophilized powder on asthma in mice models of chronic bronchitis（n＝15）

3.4 蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎模型大鼠病理改变的影响

大鼠在气道内滴入LPS后21 d间，出现倦怠，活动减少，进食及饮水减少，可听见明显的气道痰鸣音。各用药组ig10 d后，痰鸣音逐渐减轻；模型对照组大鼠气道痰鸣音改变不明显。大体标本所见:肺组织膨胀肿大，呈灰白色，表面无出血及液体渗出。

显微镜所见:模型组大鼠气道内分泌物明显增多，上皮不完整，气道腺体增厚，气管黏膜层、黏膜下层大量单核炎性细胞浸润，支气管外周淋巴滤泡形成；地塞米松组和蛞蝓冻干粉高、中、低剂量组大鼠气道内分泌物减少，气管上皮层基本完整，气管壁和腺体层较模型组变薄，黏膜下炎性细胞浸润减轻，支气管外周淋巴滤泡小。地塞米松组和蛞蝓冻干粉高剂量组与模型对照组比较有明显差异。肺脏组织病理学检查见图1。

图1 肺脏组织病理学检查（HE染色，×40）A.模型对照组；B.氨茶碱组；C.蛞蝓冻干粉低剂量组；D.蛞蝓冻干粉中剂量组；E.蛞蝓冻干粉高剂量组Fig 1 Pathological observation of lung tissue in each group（HE staining，×40）A.model control group；B.aminophylline group；C.Limax lyophilized powder low-dose group；D.Limax lyophilized powder medium-dose group；E.Limax lyophilized powder high-dose group

4 讨论

慢性支气管炎是指气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。临床上以咳嗽、咳痰或伴有喘息及反复发作的慢性过程为特征，属中医咳嗽、喘症、肺胀等范畴。该病若缓慢进展，常并发阻塞性肺气肿，甚至肺动脉高压、肺原性心脏病[4]。

蛞蝓，作为一种药用动物源远流长，早在古代的中医药著作中就对蛞蝓清热解毒、活血化瘀、软坚散结等功能，常用于治疗咳、喘、痰鸣、咽喉肿痛等症候都有详细的记载[5]。其近年的临床应用主要集中在治疗慢性支气管炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺系疾病和抗癌作用两大方面。而国外研究者仅利用蛞蝓作为嗅觉和味觉神经调控的动物模型来研究[6]。蛞蝓冻干粉是以广西百色地区出产的足襞蛞蝓新鲜全虫，经匀浆、冻干后制备的胶囊剂，按《药品注册管理办法》规定，为新发现的药材及其制剂，属中药2类新药。根据其以蛞蝓为药材，以平喘为主要功效的特点，从而命名为蛞蝓冻干粉。

本研究采用SO2吸入法和LPS注入法复制小鼠和大鼠的慢性支气管炎模型，并分别采用SO2刺激法进行止咳实验、气管段酚红法进行化痰实验、喷雾致喘法进行平喘试验，并行病理组织观察，以考察蛞蝓冻干粉治疗慢性支气管炎的止咳、化痰和平喘的功效，以及对炎症病理改变的治疗作用。研究结果表明，蛞蝓冻干粉能明显延长咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，具止咳作用；能使小鼠气管段酚红排泄量明显增加，提示化痰作用增强；能延长组胺-乙酰胆碱诱发的哮喘潜伏期，提示具平喘作用；并能改善慢性支气管炎模型大鼠的炎症病理改变。可见，蛞蝓冻干粉对慢性支气管炎具较好的治疗作用。

[1]陈 奇主编.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社，2006:224.

[2]施新猷主编.现代医学实验动物学[M].北京:人民军事出版社，2000:447.

[3]马 楠，崔德健，梁延杰，等.气道内注入脂多糖法建立大鼠慢性支气管模型[J].中华结核和呼吸杂志，1999，22（6）:371.

[4]周 跃，孙仁华.乌拉地尔治疗肺动脉高压、肺心病、心力衰竭的疗效及对血流动力学影响[J].中国药房，1998，9（3）:125.

[5]江苏新医学院.中药大辞典（下册）[M].上海:上海科学技术出版社，1977:2375.

[6]Watanabe S，Inoue T，Murakami M，et al.Modulation of oscillatory neural activities by cholinergic activation of interneurons in the olfactory center of a terrestrial slug[J].Brain Research，2001，896（1-2）:30.