海藻酸钙-活性炭纤维固定化生物小球的强化除苯性能

刘秀丽，赵 林，刘涉江，游璐华

(天津大学环境科学与工程学院，天津 300072)

地下水中苯系物(benzene，toluene ethylbenzene，xylene-volatile aromatic compounds，BTEX)的污染呈逐年累加增重的态势，利用微生物修复苯系物污染地下水的方法已成为当前的研究热点[1-4]．传统的微生物修复技术存在细胞易流失、无法重复利用等缺点，包埋技术是将微生物包埋于载体骨架中，使其免受有机污染物的毒害，不仅提高有效生物量、降低细胞重建的费用，而且具有稳定的降解性能，已广泛应用于地表水有机污染物的去除研究中[5-8]．混合菌虽然结构复杂但种群丰富，能够高效地去除污染地下水中的BTEX混合物[9]．苯的6个Π电子处于完全离域状态从而形成大Π键[10]，对于BTEX来说，苯的化学结构最稳定，因此其生物降解的启动最困难．炭材料应用于水体污染治理的研究越来越多[11-14]，活性炭纤维作为一种新型的水处理材料，具有较高的吸附性能、机械强度和生物相容性，因此更易于微生物固着，已有将其应用于固定化生物降解苯酚的研究[15]．

笔者选取天津大港油田区长期被石油污染的土壤，对其进行有目的的富集驯化，得到能够降解BTEX的优势混合菌；以海藻酸钙(calcium alginate，CA)、活性炭纤维(activated carbon fiber，ACF)为包埋载体，实现混合菌的生物固定化．在确定最佳包埋条件下，对固定化生物小球(immobilized bio-bead，MB)的微观结构进行扫描电镜观察，并以苯为 BTEX的代表对象，研究了 MB对苯的生物降解性能，进一步探讨了不同接种量的影响及其可重复利用性．

1 材料和方法

1.1 实验材料

海藻酸钠(sodium alginate，SA)：分析纯；氯化钙(CaCl2)：分析纯；黏胶基活性炭纤维(ACF)毡：比表面积为1,280,m2/g，孔径为2.0,nm，孔容积为0.9,mL/g，碘吸附值为1,150,mg/g．

包埋所用活性炭纤维：黏胶基纤维毡置于 110,℃烘箱中烘干2,h，经研磨过100目筛后备用．

包埋菌源：选取天津大港油田区长期受石油污染的土壤，对其进行好氧富集并采用BTEX混合基质进行驯化，获得BTEX优势降解菌．

1.2 实验方法

笔者制备的新型海藻酸钙-活性炭纤维生物固定化小球鲜见报道．选择海藻酸钠作为包埋剂，氯化钙溶液作为交联剂．将质量分数为1%的ACF与20,mL含 4%(质量分数)的 SA 溶液混合制备成包埋剂，取一定量处于对数生长期的优势菌液，经离心称重后与包埋剂混合均匀．采用蠕动泵，将上述混合溶液泵入到含4%(质量分数)的CaCl2交联溶液中固化成球．

将100,mL培养基置于750,mL自制的密闭生物降解反应器内，经充分曝气后，加入MB置于转速 150,r/min的恒温摇床中，降解实验条件为温度 30,℃，pH值7.5～8.0．培养基组成如下：KH2PO4为 70,mg/L，K2HPO4为 50,mg/L，(NH4)2SO4为 100,mg/L，MgSO4·7H2O 为 1,mg/L，CaCl2为 1,mg/L，FeSO4·7H2O 为3,mg/L，MnSO4·H2O 为 4,mg/L，ZnSO4·H2O 为5,mg/L．为考察 MB可重复利用性能，待降解实验结束后取出 MB，以无菌生理盐水冲洗多次后重新加入新鲜培养基，苯的加入量相同，以 24,h为周期测定苯浓度变化．

1.3 分析方法

液相中苯的浓度采用气相色谱外标峰面积法测定：Agilent,6890N 气相色谱仪，配有 FID 检测器和HP-5型毛细管柱．分析条件为：柱温40,℃，进样口温度 200,℃，检测器温度 250,℃，H2流量 40,mL/min，空气流量 550,mL/min．采用 Philip XL-30型扫描电镜观察MB外部和内部的微观结构，MB经冷冻干燥和镀金处理后置于扫描电镜下进行观察．

2 结果及讨论

2.1 MB的微观结构

采用上述方法所制备的MB，其直径为2～4,mm．通过扫描电镜对MB微观结构进行观察，结果如图1所示．从图1(a)中可以看出，MB表面并非光滑致密，ACF均匀分布在其表面；从图1(b)中可以看出，MB内部孔隙紧密均匀、孔径大小一致；图1(c)所示是随机选取的MB的孔隙，测定其孔径大小平均为200,µm；图1(d)所示是局部放大后观察到的MB内部附着的微生物．由此可见，该方法所制备的MB，具有表面通透、孔道致密、孔径均一的特点，并能为微生物提供足够的附着空间．此外ACF均匀地分布和镶嵌在MB的表面和内部，不仅增加了MB骨架结构的稳定性、提高了机械强度，而且有利于将苯大量吸附到 MB表面，从而加强苯的富集和微生物的进一步降解．

2.2 MB强化除苯效果

采用添加和不添加菌体两种方式分别制备固定化小球，离心13.7,mg菌体混于20,mL包埋溶液中制备成 MB，而 CA-Blank和 CA-ACF-Blank分别作为空白对照，其中CA-Blank指未包埋微生物和ACF的固定化小球，CA-ACF-Blank是指未包埋微生物而添加了 ACF所制备的固定化小球．CA-Blank、CAACF-Blank两种非生物固定化小球和生物固定化小球MB去除苯的实验结果如图2所示．图中C为时间 t时液相苯浓度，C0为苯初始浓度．结果表明：MB在反应120,h内对苯的去除率达到80%，而CA-Blank和CA-ACF-Blank的苯去除率分别达到20%和50%；相同时间内，去除率由大到小的次序为 MB＞CAACF-Blank＞CA-Blank．此外，反应结束前，CA-Blank的培养基逐渐混浊，少量固定化小球出现溶解破裂．分析认为这主要是由于未添加 ACF的 CABlank，其机械强度较差，在一定盐度和转速条件下易发生水溶解体．这也说明 ACF作为包埋载体，不仅起到骨架支撑作用而且能有效改善包埋固定化小球的机械强度．

图1 MB扫描电子显微照片Fig.1 Scanning electron micrographs of MB

对于强化除苯过程来说，CA-Blank和 CA-ACFBlank对苯的去除主要是吸附作用，而ACF作为改性的包埋载体，具有更高的比表面积和孔容积，对苯的吸附能力更强；因此，从苯的去除效果来看，CAACF-Blank较CA-Blank更好．对于MB来说，其强化除苯表现为快速和慢速两个阶段：反应12,h内苯的去除率较高，之后趋缓．对上述两阶段苯浓度随时间变化的数据进行拟合，其一级动力学方程分别为 ln,C＝-0.082,4t +5.148,8(R2＝0.965,6)和ln,C＝-0.012,9t+4.354,9(R2＝0.976 8)，对应的速率常数分别为0.082,4 mg/(L·h)和 0.012 9 mg/(L·h)．比较 CABlank、CA-ACF-Blank和生物固定化小球MB强化除苯的实验数据，分析认为MB对苯的去除主要是吸附作用和生物降解共同作用的结果．液相中苯的浓度相对较低，CA和ACF载体能够将苯大量吸附到MB表面，强化了MB对苯的去除效果．

2.3 接种量的影响

在 20,mL包埋剂溶液中分别加入 13.7,mg、68.8,mg、137.7,mg和413.3,mg离心后的菌体，交联成球后加入到100,mL的新鲜培养基中进行强化除苯的实验，结果如图3所示．

图3 不同接种量条件下MB强化除苯的实验结果Fig.3 Effects of enhanced biodegradation of benzene by MB under different inoculum densities

实验结果表明，随着接种量的增加，MB对苯的去除率依次增大，而去除速率的变化表现为由快速到慢速的两阶段性．采用一级动力学方程对实验结果 进行拟合，拟合结果见表1．

表1 不同接种量条件下MB强化除苯过程的拟合结果Tab.1 Fitting results of enhanced biodegradation of benzene under different cell densities

从表1中的拟合结果可以看出，MB强化除苯的速率常数均随接种量的增加而增大．当接种量达到413.3,mg时，苯的去除率可达到 100%；但反应进行40,h左右时培养基中出现黑色颗粒，反应 72,h后形成黑色絮状体，分析认为这主要是由于接种量过大造成菌体迅速增殖，从而导致了 MB微观结构破坏，使得镶嵌较为松散的ACF溶出团聚所致．可见，接种量过低将导致苯的去除率和去除速率降低，而接种量过大则不利于保持MB的结构稳定，最终导致MB有效生物量降低．综上认为，接种量为 137.7,mg时所制备的MB具有最稳定的结构和最佳强化除苯效果．

MB强化除苯过程主要包括快速吸附和吸附-降解共同作用两个阶段，其中第2阶段主要以生物降解作用为主．因此可采用该阶段一级动力学常数计算包埋微生物降解苯的半衰期[16]，计算式为

式中 k1为一级降解速率常数．根据式(1)计算得到不同接种量条件下 MB包埋微生物降解苯的半衰期平均值为 64,h，高于游离态 BTEX降解菌的半衰期[17]，这主要是由于MB传质过程不同所致，而采用固定化技术的确有利于保持微生物活性，避免高浓度底物的毒害作用；此外 MB制备过程选择 ACF作为改性载体有助于苯大量富集在MB表面，增加微生物与苯的接触时间，从而起到了强化除苯的效果．

2.4 MB稳定性和可重复利用性

为考察MB的可重复利用性，待强化除苯实验结束后，取出 MB用无菌生理盐水冲洗多次，置于初始苯浓度为50,mg/L的新鲜培养基中，测定24,h内苯浓度的变化，实验结果如图4所示．

在进行7个周期的重复利用实验后，MB球体完好且未出现球体松散和 ACF溶出的现象．从图 4的实验结果可以看出，在可重复利用实验中，苯的去除过程和去除速率均呈现整体递减的趋势而并未出现先吸附后降解的两阶段过程，说明MB的重复利用实验中强化除苯的效果稳定可靠，而MB至少可以重复利用8次．因此可以认为ACF作为包埋载体能够改善 MB的骨架结构，提高其机械强度，从而增加 MB对底物苯的耐受能力，并且添加 ACF的固定化生物小球具备良好的可重复利用性和工程化潜力．

图4 MB的可重复利用性Fig.4 Reusability of MB

3 结 论

(1) 该方法所制备 MB直径为 2～4,mm．扫描电镜结果表明：MB表面通透，孔道致密，孔径均一，孔径大小约为 200 µm；ACF较为均匀地分布在 MB的表面和内部．

(2) 结合CA-Blank、CA-ACF-Blank两种非生物固定化小球的对照实验认为，MB强化除苯过程主要包括快速吸附阶段和吸附-生物降解共同作用阶段；而包埋微生物对苯降解的半衰期要大于游离微生物的降解半衰期．

(3) 接种量不仅影响着 MB微观结构的稳定性，而且直接决定了强化除苯的效果．本研究中的最佳接种量为 6.89 mg/mL(菌体/包埋溶液)．在最佳接种量条件下，MB至少可重复利用 8次，并且保持球体完整和较好的强化除苯效果．(4) ACF是一种优良的包埋固定化载体，不仅能够改善 MB的骨架结构、提高其机械强度，而且增加了MB对苯的耐受能力，从而使MB具备良好的可重复利用性和工程化潜力．

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