车前子多糖致突变毒性的实验研究

2011-05-08郭会彩王素敏牛玉杰王永利

河北医科大学学报 2011年7期

关键词：微核车前子骨髓细胞

郭会彩，孙瑶，王素敏，牛玉杰，张荣，王永利*

（1.河北医科大学公共卫生学院毒理学教研室，河北石家庄 050017；2.河北医科大学基础医学院药理学教研室，河北石家庄 050017）

车前子多糖致突变毒性的实验研究

郭会彩1，孙瑶1，王素敏2，牛玉杰1，张荣1，王永利2*

（1.河北医科大学公共卫生学院毒理学教研室，河北石家庄 050017；2.河北医科大学基础医学院药理学教研室，河北石家庄 050017）

目的探讨车前子多糖对小鼠体细胞和生殖细胞的致突变作用。方法将体质量20～26g健康小鼠100只，雌雄各半，随机分为5组，分别为阴性对照组（蒸馏水，diStilled Water）、阳性对照组（环磷酰胺，cyclophoSphamide）和车前子多糖3个剂量组（剂量分别为100、200、400mg/kg）。阴性对照组及车前子多糖3个剂量组均灌胃给药，阳性对照组腹腔注射。采用间隔24h，连续7次给药，于末次给药后6h将小鼠处死，用于微核、染色体畸变检测。另取雄性小鼠50只（15～1Sg），分组及给药同上，在第1次给药后第35天观察精子畸形率。结果车前子多糖诱发的微核、染色体畸变和精子畸形率与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.01）。结论车前子多糖对小鼠体细胞和生殖细胞均无致突变作用。

车前子多糖；突变；小鼠

车前子为车前属植物（plantago aSitica L）的干燥成熟种子，从本草学考证，具有清热利尿、肾湿通淋、明目祛痰的功效，近代研究表明具有广泛的生物学活性，诸如致泄、护肝、改变胆汁酸吸收和肝胆固醇代谢、抗炎抑菌、切口愈合、止痛、抗氧化、免疫调节、提高机体免疫力、降压、降低血清胆固醇的作用［1，2］。车前子多糖则是从车前子中提取的多糖成分，近年来对其的药效学研究逐渐增多，如整肠通便、抗衰老、抗氧化、增强免疫功能等作用［3，4］，说明车前子多糖具有潜在的开发应用前景。但是关于车前子多糖的致突变研究作者尚未见报道。本研究通过观察车前子多糖对小鼠体细胞和生殖细胞的致突变作用，探讨车前子多糖对小鼠的遗传毒性，为车前子多糖的安全使用提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康昆明白种小鼠150只，体质量20～26g（精子畸形实验小鼠体质量为15～1Sg），医动字第703046号，河北医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要器材：CHD显微镜，日本OlympuS公司；D-7S532高速冷冻离心机，德国Hettich zentrifugen公司；DK-SA水浴箱，上海医用恒温设备厂。

1.1.3 主要试剂：车前子购自东北吉林药材公司。秋水仙素，Sigma公司；环磷酰胺，沈阳药大药业有限责任公司；GiemSa，上海试剂三厂；甲醇（分析纯），天津市化学试剂一厂；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 车前子多糖提取方法［5］：①车前子与水1∶15微波中高火加热1min。②过滤。滤液抽滤。③滤液至于旋转蒸发仪减压蒸馏至原滤液的1/30。④用2倍无水乙醇沉淀过夜。⑤过滤沉淀。沉淀用少量水溶解，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，然后加氯仿体积1/5的丁醇，剧烈振摇20min，离心，分去水层与溶液层交界处的变性蛋白。重复5次。⑥过滤沉淀，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2次。⑦干燥。

1.2.2 动物分组及处理：取100只小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组20只，分别为阳性对照组（环磷酰胺40mg/kg），阴性对照组（蒸馏水），车前子多糖高（400mg/kg）、中（200mg/kg）、低（100mg/ kg）3个剂量组。阳性对照组腹腔注射给药，给药组及阴性对照组经口灌胃给药。0.2mL/10g体质量，采用间隔24h，连续7次给药，于末次给药后6h将小鼠处死，用于微核、染色体畸变检测。另取50只雄性小鼠随机分为5组，每组10只，给药剂量方法同前，末次给药后继续喂养30d，处死后用于精子畸形检测。

1.2.3 小鼠骨髓细胞微核实验［6］：末次给药后6h，脱臼处死小鼠，取胸骨骨髓制片，甲醇固定15min，10%吉姆萨染色10min，每只小鼠计数1 000个嗜多染红细胞，计算微核发生率。同时计数200个红细胞，求出多染红细胞/正染红细胞的比值（polychromaticerythrocyte/normochromatic erythrocyte，PCE/NCE）。

1.2.4 小鼠骨髓细胞染色体畸变实验：末次染毒后6h取材，处死前4h，腹腔注射秋水仙素，取股骨，用磷酸盐缓冲液冲出骨髓细胞，经低渗，固定制片，10%吉姆萨染色15min，每只小鼠观察100个中期分裂相细胞，计算染色体畸变率。

1.2.5 小鼠精子畸形实验：颈椎脱臼法处死，取双侧附睾，制片，每只小鼠观察500个精子，计算精子畸形率。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间两两比较采用SNK q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 车前子多糖对小鼠体细胞的致突变作用

2.1.1 小鼠骨髓细胞微核率变化：阳性对照组小鼠骨髓细胞微核发生率明显高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。车前子多糖各剂量组小鼠骨髓细胞微核发生率与阴性对照组比较无明显升高，差异无统计学意义（P＞0.05）；各给药剂量组多染红细胞/正染红细胞的比值与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明车前子多糖对骨髓细胞无明显抑制作用。见表1。此结果提示车前子多糖无诱导小鼠骨髓细胞微核率增加的作用。

表1 车前子多糖对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响Table 1 The effects of plantain seed polysaccharid on micronucleus of bone marrow cell （n=10，±s）

*P＜0.05 vS diStilled water group by q teStPSP：plantain Seed polySaccharid；PCE/NCE：polychromatic erythrocyte/ normochromatic erythrocyte

GroupS MicronucleuS of bone marrow cell CellSMicronucleuS rate（‰）PCE/NCE DiStilled water1 0002.5±0.S51.32±0.25 PSP 100mg/kg1 0002.7±0.S21.25±0.30 PSP 200mg/kg1 0002.9±0.741.26±0.32 PSP 400mg/kg1 0003.S±0.791.36±0.2S CyclophoSphamide1 00030.S±2.53*1.29±0.33

2.1.2 小鼠骨髓细胞染色体畸变率变化：小鼠经车前子多糖作用后，车前子多糖低、中、高3剂量组均可观察到畸变的染色体。比如，断片，断裂等。采用方差分析及SNK两两比较，车前子多糖3个剂量组与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），而相同条件下的阳性对照组骨髓细胞染色体畸变率显著高于阴性对照组（P＜0.05），见表2。提示车前子多糖无诱导小鼠骨髓细胞染色体畸变率增加的作用。

表2 车前子多糖对小鼠骨髓细胞染色体畸变率的影响Table 1 The effects of plantain seed polysaccharid on chromosomal aberration of bone marrow cell （n=10，±s）

*P＜0.05 vS diStilled water group by q teStPSP：plantain Seed polySaccharid

GroupSCellSMalformation rate（%）DiStilled water1003.4±1.07 PSP 100mg/kg1003.5±1.0S PSP 200mg/kg1004.3±1.34 PSP 400mg/kg1004.S±1.03 CyclophoSphamide10027.1±2.3S*

2.2 车前子多糖对小鼠生殖细胞的致突变作用：小鼠经车前子多糖作用后，车前子多糖低、中、高3个剂量组均可看见畸变的精子，比如，头呈扇形，无钩等。采用方差分析以及SNK两两比较之后，3个剂量组与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05），而相同条件下的阳性对照组精子畸形率显著高于阴性对照组（P＜0.05），见表3。提示车前子多糖无诱导小鼠精子畸形率增加的作用。

表3 车前子多糖对小鼠精子畸形率的影响Table 3 The effects of plantain seed polysaccharid on sperm shape abnormality test in mice （n=10，±s）

*P＜0.05 vS diStilled water group by q teStPSP：plantain Seed polySaccharid

GroupSSperm countMalformation rate（%）DiStilled water50012.4±1.43 PSP 100mg/kg50012.9±1.60 PSP 200mg/kg50013.7±1.70 PSP 400mg/kg50014.0±1.97 CyclophoSphamide50034.7±4.06*

3 讨论

我们前期工作［3，4］研究了车前子多糖对血管内皮细胞、平滑肌细胞增殖作用的影响及其可能机制，取得了一定的结果，表明本产品具有明显的抗氧化清除自由基作用，能阻滞氧化修饰低密度脂蛋白的产生，并通过释放一氧化氮使血管松弛和保护动脉内皮作用。并对车前子多糖的一般药理学研究及急性毒性进行了评价［7］。

特殊毒性实验回答的是潜在性危险问题，其中致突变性实验是特殊毒性实验的重要内容之一，对于常用的中药和待开发的中药能否引起突变，是否具有远期致癌效应，不仅是毒理学研究的重要内容，也是当前人们所共同关心的问题。为了保证安全使用车前子多糖，对其进行安全性评价是很有必要的。本实验通过观察车前子多糖对小鼠体细胞和生殖细胞的致突变作用，探讨了车前子多糖对小鼠的遗传毒性，表明车前子多糖均无诱导小鼠骨髓细胞微核率，骨髓细胞染色体畸变率，以及生殖细胞精子畸形率增加的作用。提示车前子多糖对小鼠体细胞和生殖细胞均无致突变作用。但就确定药物的遗传毒性而言，除体内实验外，尚需进行体外试验。

［1］张杰，李兴琴，王素敏，等.车前子对高脂血症大鼠血脂水平及抗氧化作用的影响［J］.中国新药杂志，2005，14（3）：299-301.

［2］王素敏，张杰，李兴琴，等.车前子对高脂血症大鼠脂质过氧化的影响［J］.营养学报，2003，25（2）：212-213.

［3］袁从英，熊晨，郭会彩，等.车前子多糖抗脂质过氧化作用的研究［J］.中国老年学杂志，2009，29（10）：1202-1203.

［4］张宁，王素敏，车文文，等.车前子多糖抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖及其机制［J］.细胞生物学杂志，2009，31（5）：6S3-6SS.

［5］付志红，谢明勇，聂少平.微波技术用于车前子多糖的提取［J］.食品科学，2005，26（3）：151-153.

［6］文娟，王姗姗，牛玉杰，等.异丙莠对小鼠的致突变性研究［J］.河北医科大学学报，2010，31（1）：9-12.

［7］熊晨，王娜，王素敏，等.车前子多糖一般药理学研究［J］.白求恩军医学院学报，200S，6（4）：196-19S.

EXPERIMENTAL STUDY ON THE MUTAGENIC EFFECTS OF PLANTAIN SEED POLYSACCHARID

GUO Hui-cai1，SUN Yao1，WANG Su-min2，NIU Yu-jie1，ZHANG Iong1，WANG Yong-li2*
（1.Department of Toxicology，the School of Public Health，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Pharmacology，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo obServe the mutagenic effectS of plantain Seed polySaccharid（PSP）on miceˊS Somatic cellS and germ cellS.MethodsA total of 100 healthy mice with the body weight between 1S～22g，half male and half female，were randomly divided into five groupS.CyclophoSphamide and diStilled water were given to the mice in poSitive control group and negative control group reSpectively.And in treatment groupS，PSP were given at different doSeS（100mg/kg，200mg/kg and 400mg/kg）.In poSitive control group，cyclophoSphamide waS injected intraperitoneally.In treatment groupS and in negative control group，PSP and diStilled water were given by the gavage at a 24-hour interval for Seven timeS.MicronucleuS and chromoSome aberration rate of bone marrow cellS were obServed.On the other hand，50 male healthy mice（15～1Sg）were divided and treated aS above for the teSt of Sperm abnormality.ResultsThere were no Significant differenceS in micronucleuS of bone marrow cellS，chromoSomal aberration of bone marrow cell and Sperm malformation rate between treament group and negative control group（P＞0.01）.ConclusionPSP have no mutagenic effectS on Somatic cellS and germ cellS.

plantain Seed polySaccharid；mutation；mice

I2S5.5

1007-3205（2011）07-075S-03

2011-02-24；

2011-05-03

河北省中医药管理局资助课题（201007S）

郭会彩（1976-），女，河北栾城人，河北医科大学公共卫生学院讲师，医学博士，从事药物毒理学研究。

*通讯作者

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.005