HBx和HIF-1α在肝癌血管生成中的关系及临床意义

刘凯歌， 许刚柱， 赵 慧， 徐 莉， 徐 锐， 姚 杨 (西安医学院附属医院消化科， 西安 710077; 通讯作者，E-mail:kaigeliu@gmail.com)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，HBV作为HCC的致病因子已被公认，HBV的X基因编码产物X蛋白(HBx)在HBV相关肝细胞肝癌形成、发展和浸润中发挥重要作用［1－3］。缺氧诱导因子 －1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)作为真核细胞转录因子，其α亚单位HIF-1α存在于缺氧细胞的细胞核中，参与缺氧诱导的特异反应，促进多种基因转录，而且还能够诱导多种参与肿瘤增殖和转移的酶的表达，促进肿瘤的增殖和转移［4－6］。HCC是一高度血管化的肿瘤，作为HCC高危因素的HBx和肿瘤相关分子HIF-1α对其恶性生物行为的作用如何?本研究检测了84例乙肝相关性肝癌组织和22例非乙肝相关性肝癌组织中HBx、HIF-1α及血管内皮细胞表面抗原(CD34)的表达，通过肝癌组织中微血管密度(MVD)所见，探讨HBx和与HIF-1α乙肝相关性肝癌组织血管生成及转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 106例人肝细胞肝癌组织来源于2003－01～2006－03西安医学院附属医院及第四军医大学西京医院手术切除病理标本，所有病例术前均未行化疗、放疗及其他辅助治疗。主要试剂:HIF-1α单克隆抗体及HBx单克隆抗体(美国Neo-Markers公司产品)，CD34抗体(北京中杉生物工程有限公司产品);免疫组化SP试剂盒(福州迈新生物技术开发公司产品)。

1.2 免疫组织化学 SP法检测人肝细胞肝癌组织中HIF-1的表达。按常规步骤进行，其中鼠抗HBx单克隆抗体滴度为1∶400，HIF-1α及CD34抗体滴度均为1∶100，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:阳性表达判定参照文献采用半定量积分法，即对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度进行分级记分，然后根据两项之和确定其阳性强度。仅细胞核着蓝色者为阴性，胞膜、胞质或胞核呈棕黄色者为阳性。0分为阴性，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳性。阳性细胞率即阳性细胞占计数细胞的比例，以计数10个高倍视野细胞为准，阳性细胞≤5%为0分，6% －30%为1分，31% －70%为2分，≥71%为3分。两项之和1－3分为低表达，4－6分为高表达。MVD计算参照Weidner［7］方法，即先在低倍镜下观察切片全视野，选择血管内皮细胞染色最多的视野，高倍镜下记数3个视野的微血管数，取其平均值作为MVD。

2 结果

2.1 HBx的表达 84例乙肝相关性肝癌组织HBx阳性表达率73.81%(62/84)，阳性表达细胞胞质呈棕黄色(图1)，阴性表达22例，HBx在低分化组阳性率低于高分化组(P＜0.05)。62例阳性表达者中，早期癌占 66.13%(41/62)，进展癌占 33.87%(21/62)，早期癌高于进展期癌，两组差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图1 HBx在高分化肝癌组织(A)、低分化肝癌(B，左上)和癌旁组织(B，右下)中的表达 (×200)Fig 1 The expression of HBx in well differentiated(A)，poorly differentiated(B，upper left)and pericancerous tissues(B，lower right)(×200)

2.2 HIF-1α的表达 HIF-1α阳性表达细胞以胞质为主，呈棕黄色(图2)。62例HBx阳性表达组中的HIF-1α 阳性率为 69.39%(43/62)，明显高于HBx阴性表达组40.91%(9/22)和非乙肝相关性肝癌组36.36%(8/22)(P ＜0.05);HBx阴性表达的乙肝相关性肝癌组和非乙肝相关性肝癌组中HIF-1α阳性表达差异无统计学意义(P＞0.05)，但HIF-1α阳性表达在进展期癌高于早期癌，随着肿瘤体积的增大、组织分化程度的升高，阳性表达率升高，且转移组表达高于无转移组。

图2 HIF-1α在高分化肝癌组织(A)和低分化肝癌组织(B)中的表达(×200)Fig 2 The expression of VEGF in well differentiated(A)and poorly differentiated(B)hepatocellular carcinoma tissues(×200)

2.3 MVD计数 CD34抗体阳性细胞呈棕黄色表达，多在毛细微血管的内皮细胞核表达(图3)。62例HBx阳性表达组中 MVD平均计数为50.19±16.62;其中21例早期癌MVD平均计数为42.37±12.75，41例进展期癌 MVD平均计数为55.72±17.30，两组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。HBx阴性表达的乙肝相关性肝癌组MVD平均计数为38.42 ±8.67，非乙肝相关性肝癌组为 30.38 ±4.99，二者比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，而HBx阳性表达组MVD平均计数与前二者比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。HIF-1α阳性组MVD高于阴性组，差异有统计学意义(51.56±17.79 vs 34.25 ±12.36，P ＜0.05)。

图3 CD34在早期(A)和进展期(B)肝癌组织中的表达(×200)Fig 3 The expression of CD34 in earlier(A)and advanced(B)hepatocellular carcinoma tissues

2.4 HBx、HIF-1α 及 MVD的关系 在84例肝癌组织中，HBx和 HIF-1同时阳性占51.19%(43/84)，同时阴性占15.48%(13/84)。相关性分析表明，HBx与 HIF-1α 表达呈正相关(rs=0.573，P ＜0.01)。HBx高表达组MVD高于低表达组，但差异无统计学意义(51.89 ±19.32 vs 50.72 ±13.77，P ＞0.05);HIF-1α高表达组MVD低于低表达组，差异亦未见统计学意义(44.23±15.12 vs 62.23±18.45，P ＞0.05);HBx阳性表达组 MVD 值明显高于HBx阴性组和非乙肝相关性肝癌组(P＜0.01)，有转移组MVD高于无转移组(P＜0.01);有门脉侵犯组高于无侵犯组(P＜0.05)。

2.5 乙肝相关性肝癌中HBx、HIF-1α表达及MVD计数与临床病理指标的关系 HBx、HIF-1α的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)及肿瘤包膜浸润无明显相关，但与门静脉侵袭转移和淋巴结转移均密切相关(P＜0.05，见表1)。MVD高分化组表达阳性率高于低分化组(P＜0.05);淋巴结有转移组高于无转移组(P＜0.05)。单因素方差分析TMN各期间MVD计数比较差异有统计学意义(P ＜0.01 －0.05，见表1)。

表1 乙肝相关性肝癌中HBx、HIF-1α表达及MVD计数与临床病理指标的关系Tab 1 Relationship of HBx，HIF-1α and MVD with the clinicopathological features in HBV-related hepetocellular carcinoma

3 讨论

HBx是乙肝病毒的X开放读框编码的乙肝病毒X蛋白，是一种重要的转录激活因子，它具有广泛的反式激活作用，能够影响细胞信号转导途径，激活多种病毒及细胞基因启动子，干扰细胞基因的转录和表达，影响细胞分化和增殖等生物学功能，是乙肝相关性HCC的一个主要因素，与肝细胞癌的发生、发展及转移关系非常密切［8，9］。肿瘤细胞快速生长、浸润必然造成肿瘤组织缺氧，缺氧导致多种氧反应基因表达上调，其中以HIF-1的表达最为敏感。在缺氧条件下表达增加的转录因子HIF-lα在介导肿瘤缺氧适应过程中发挥主导作用［10］，与肿瘤血管生成及转移密切相关。

本实验结果提示HBx和HIF-1α广泛表达于乙肝相关性肝癌组织中，HBx阳性表达在早期癌高于进展期癌，而HIF-1α阳性表达在进展期癌高于早期癌;HBx阳性表达组中的HIF-1α阳性率明显高于HBx阴性表达组和非乙肝相关性肝癌组，这些提示HBx和HIF-1α的表达增高是肝癌发生中的重要生物事件。

血管形成在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，新生血管为肿瘤生长提供足够的营养供应，是肿瘤生长、浸润、转移中不可或缺的重要因素。目前评价人类肿瘤血管形成的较好办法仍是微血管定量，本实验应用免疫组化法通过CD34表达检测MVD，分析HBx、HIF-1α及MVD的关系发现:HBx阳性表达组MVD明显高于HBx阴性组和非乙肝相关性肝癌组，进展期癌组的MVD高于早期癌组，有淋巴结转移组和有血管侵犯组的MVD也明显高于阴性组，提示HBx蛋白的高表达在肝癌组织血管生成及转移过程中起着重要的作用，而HIF-1α表达及MVD计数与临床病理指标的结果分析同样说明HIF-1α在肝癌血管生成及转移过程中也起着促进作用，两种蛋白可能在肝癌组织血管生成及转移过程中具有协同作用。

通过本实验还发现，肝癌组织中HBx与HIF-1α表达呈现高度的相关性。Moon等［11］发现HBx有可能通过稳定HIF-1α而诱导肿瘤血管生成;我们的研究也发现HBx可能通过上调VEGF的表达在乙肝相关性肝癌组织血管生成及转移中起促进作用［3］，并且证实 HBx可上调 HIF-1α［12］，说明在肝细胞癌的发生发展中，HBx可能通过上调HIF-1α的表达，从而促进肿瘤血管生成及转移。

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