膀胱移行细胞癌中间隙连接蛋白Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA和Bax mRNA的表达及其相关性研究

吴志平，赵晓昆，吕 晨，杨明根，肖 宁

细胞间隙连接 (gap junction，GJ)是普遍存在于动物组织细胞间的一种通讯方式，主要由间隙连接蛋白 (connexin，Cx)所构成。细胞通过细胞间隙连接通讯 (gap junction intercellular communication，GJIC)进行细胞间信号的传递，调控细胞的新陈代谢、增殖、分化等生理过程，对机体的代谢平衡及生长发育有重要意义［1］。研究发现GJ与肿瘤的发生、发展及侵袭转移潜能密切相关，其中Cx43是一种主要的细胞间隙连接蛋白，在多种癌细胞中都有Cx43表达的下降，是研究的热点［2］。本研究通过半定量RT－PCR的方法检测Bcl－2 mRNA，BaxmRNA及Cx43mRNA在膀胱移行细胞癌 (BTCC)组织中的表达，探讨Cx43基因与凋亡相关基因Bcl－2、Bax蛋白表达的相关性及其生物学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2007年6月—2008年6月中南大学湘雅二医院泌尿外科手术切除并经病理证实的BTCC患者新鲜组织标本35例，癌组织取肿块非坏死部分。选择同期BTCC患者距肿瘤边缘2 cm的癌旁组织21例、正常膀胱组织15例，其中良性前列腺增生手术取正常膀胱组织9例，BTCC患者手术取距肿瘤边缘＞5 cm膀胱组织6例。35例BTCC患者术前均未行任何放、化疗，其中男21例，女14例;年龄38～72岁，平均 (58.6±10.2)岁;初发肿瘤23例，复发肿瘤12例;肿瘤单发21例，多发14例;肿瘤直径＜3 cm 18例，≥3 cm 17例;肿瘤分期:Ta～1期24例，T2～4期11例;肿瘤分级G1级15例，G2级11例，G3级9例。

1.2 主要试剂 Bcl－2、Bax、Cx43和人肌动蛋白 (β－actin)引物由上海生工生物工程公司合成，RT－PCR试剂盒(两步法)购自Promega公司，PCR产物回收纯化试剂盒、Taq DNA聚合酶和dNTPs试剂购自Takara公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司。

1.3 实验方法 所有标本 (肿瘤组织、癌旁组织，正常膀胱组织)经－196℃液氮罐取回并置于－70℃冰箱保存。

1.3.1 引物设计 根据Bcl－2、Bax、Cx43、β－actin的mRNA序列 (genebank序列号NM_000633、NM_138764、NM_000165、NM_001101)，应用在线引物设计软件primer3设计相关引物 (见表1)。

1.3.2 组织标本总RNA的提取与鉴定 各种标本分别取50～100 mg组织，用匀浆器将组织彻底匀浆后，在冰上加入1 ml Trizol，提取组织总RNA，提取步骤参照Trizol试剂的说明书进行。用Trizol提取组织总RNA的吸光度比值 (即OD260/OD280值)均达1.7～1.9。

1.3.3 半定量RT－PCR检测 RT－PCR按照TaKaRa两步法试剂盒的说明操作，以Oligo－dT为引物反转录cDNA模板后，进行PCR反应。PCR反应条件为95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s3 min，循环30次，再72℃ 10 min。PCR结束后，分别取5 ml产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统扫描并测定标本的灰度值，重复3次并计算Bcl－2、Bax及Cx43与β－actin的表达比值来判断 Bcl－2 mRNA、Bax mRNA及Cx43 mRNA的相对表达水平。

表1 mRNA序列引物设计Table 1 mRNA sequence of primer design

1.3.4 PCR产物测序及BLAST比较分析 分别用合成的引物对PCR产物进行测序，运用DNASTAR软件中的Seqman对测序结果进行分析，证实RT－PCR产物与目的mRNA序列是否同源。

1.4 统计学方法 使用SPSS 13.0统计软件包处理数据，计量资料用 (x－±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cx43mRNA、Bcl－2mRNA及BaxmRNA在BTCC、癌旁组织及正常膀胱组织中的表达 RT－PCR扩增3种组织中的Cx43、Bcl－2、Bax基因，扩增产物经凝胶图像分析仪分析电泳结果见图1。分析其表达水平 (OD比值):Cx43/β－actin、Bcl－2/β－actin及Bax/β－actin。3种组织中Cx43mRNA表达水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.01)，其中BTCC组织中Cx43 mRNA的表达低于癌旁组织及正常膀胱组织，差异有统计学意义 (P＜0.01)。Bcl－2 mRNA在BTCC组织高表达，而在癌旁组织及正常膀胱组织中表达较低，差异均有统计学意义 (P＜0.01)。BaxmRNA在BTCC组织、癌旁组织及正常膀胱组织中的表达水平比较，差异无统计学意义 (P＞0.05);癌旁组织与正常膀胱组织中，Cx43 mRNA和Bcl－2 mRNA的表达水平比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。

表2 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA及Bax mRNA在组织中的表达 (x－±s，OD比值)Table2 The expression of Cx43mRNA，Bcl－2mRNA and BaxmRNA in 3 tissues

图1 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA和BaxmRNA在组织中的表达Figure 1 The expression of Cx43 mRNA，Bcl－2 mRNA and BaxmRNA in 3 tissues

2.2 Cx43 mRNA、Bcl－2 mRNA及Bax mRNA表达水平与BTCC临床病理特征的关系 Cx43 mRNA的表达水平在BTCC不同的病理分级间比较，差异有统计学意义 (P＜0.01)，而与患者的肿瘤分期和肿瘤有无复发比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。Bcl－2 mRNA的表达水平在BTCC不同的病理分级间比较，差异有统计学意义 (P＜0.01)。复发BTCC组织中Bcl－2 mRNA的表达水平高于初发癌组织，差异有统计学意义 (P＜0.05)。Bcl－2 mRNA的表达水平与患者的肿瘤分期比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。BaxmRNA的表达水平与BTCC患者的肿瘤分期、病理分级、肿瘤有无复发比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表3)。

2.3 PCR产物测序及BLAST分析 分别用合成的引物对PCR产物进行测序，运用DNASTAR软件中的Seqman II对测序结果进行分析，证实Cx43、Bcl－2和Bax RT－PCR产物与目的基因Cx43、Bcl－2、BaxmRNA序列完全一致 (见图2)。

表3 Cx43 mRNA、Bcl－2mRNA及BaxmRNA的表达与BTCC临床病理特征的关系 (x－±s，OD比值)Table 3 Relation of Cx43 mRNA，Bcl－2 mRNA and BaxmRNA expression with the clinicopathologic features of BTCC

图2 Cx43、Bcl－2、Bax和β－actin基因RT－PCR产物测序结果Figure 2 The sequencing results of Cx43，Bcl－2，Bax andβ－actin gene by RT－PCR

3 讨论

GJ是普遍存在于动物组织细胞间的一种通讯方式，相邻细胞间通过GJIC进行细胞间信号的传递及信息和能量物质的交换，调控细胞的新陈代谢、增殖、分化等生理过程，对细胞的生长、分化和凋亡等生理过程起着重要的调控作用，而对机体的代谢平衡及生长发育有重要意义［1］。近年来的研究发现，在肿瘤和转化细胞中普遍存在着Cx表达异常和GJIC功能缺陷［3］，提示GJIC与肿瘤发生、发展存在密切关系。GJ主要由Cx构成，Cx是一个多成员、发育上保守的大家族，目前命名的人类Cx家族成员已达21个［4］。其中 Cx43是一种主要的Cx，是间隙连接蛋白家族中分布最广、研究最多的成员，其基因表达的产物是一种磷酸化蛋白。Wilgenbus等［5］通过人肿瘤组织的冷冻切片，以免疫组织化学方法研究乳腺癌、肾细胞癌和肉瘤组织中 Cx26、Cx32和 Cx43的表达，发现 Cx26、Cx32和Cx43水平明显下降。范松青等［6］通过对不同癌组织和癌旁组织Cx43表达的研究，认为Cx43表达的缺乏或下调可能导致肿瘤的发生和发展。本研究结果显示，Cx43 mRNA在正常膀胱组织有很高的表达率，说明Cx43基因产物在正常膀胱组织内调控细胞的生长、分化和凋亡等生理过程，对正常膀胱组织功能的维持起着重要作用。Cx43 mRNA在BTCC组织中的阳性表达明显低于正常膀胱组织及癌旁组织，Cx43在BTCC中的弱表达，表明Cx43表达下降，功能性GJ通道形成减少，故GJIC功能减弱或被抑制，使来自正常细胞的生长调控信号不能到达肿瘤组织，机体失去对肿瘤细胞生长的控制，而导致肿瘤细胞无限制的自主性生长，提示间隙连接蛋白可能与多种致瘤因素共同参与了移行细胞癌的发生。国外学者通过反义核酸技术等阻断细胞Cx的表达和GJIC功能，结果导致这些细胞失去生长的控制，易形成肿瘤。这说明Cx表达的异常很可能是肿瘤 (包括BTCC)多步骤癌变过程中的重要分子机制之一［7－8］。本研究结果显示，Cx43 mRNA的表达和临床病理特征的关系表明Cx43的表达与BTCC的病理分级有关，与患者的肿瘤分期和肿瘤有无复发等无关。因此Cx43 mRNA的表达水平可作为BTCC分化程度和浸润转移能力的诊断指标。

Bcl－2和Bax是Bcl－2家族中调控肿瘤细胞凋亡中重要的一对基因，在多种上皮肿瘤中都有异常表达。现已发现Bcl－2蛋白异常表达与包括膀胱癌在内的人类多种恶性肿瘤的关系密切［9］。本研究结果发现，Bcl－2 mRNA在BTCC组织中的阳性表达明显高于正常膀胱组织及癌旁组织，并随BTCC病理分级的增高而增高，而且复发BTCC组织中Bcl－2 mRNA的表达水平高于初发BTCC。而BTCC关于Bax的表达，文献报道不一致。本研究结果发现BaxmRNA的表达在正常膀胱组织中与在BTCC组织中的表达无差异，在肿瘤各期、不同病理分级BTCC中其表达亦无差异，即表达相对恒定。有学者报道，Bcl－2在移行上皮组织有表达，但远低于癌组织，而且与恶性程度呈正相关;Bax在正常移行上皮组织与癌组织均有表达，与肿瘤分期及病理分级均无关。这种现象表明Bcl－2或Bcl－2/Bax比值可能在BTCC的恶性进展起重要作用［10－11］。

研究发现有许多促癌物通过抑制Cx的途径阻断GJIC后，细胞增殖和凋亡的调控信号传递失控，最终导致肿瘤生长，而凋亡的诱导剂可以增强Cx表达和GJIC功能，从而抑制肿瘤的生长和恶性转化，说明GJIC功能异常与癌症的发生有密切关系［12］。Krutovskikh等［13］对鼠膀胱癌细胞株 BC31 细胞的研究发现Cx43表达上调，GJIC功能增强，促进了细胞间信号的传导，增加细胞间Ca2+流的传导，最终诱导肿瘤细胞凋亡。本研究结果显示，BTCC组织中Bcl－2 mRNA高表达，Cx43 mRNA为低表达，提示Cx43 mRNA的表达与Bcl－2蛋白的表达水平相反，Cx43基因可能与凋亡相关基因Bcl－2(或Bcl－2/Bax)在BTCC的发展中起拮抗作用，其表达水平与细胞的凋亡过程有关。

综上所述，通过对BTCC组织Cx43 mRNA的表达及其与Bcl－2 mRNA/Bax mRNA表达的相关性的研究，发现Cx43表达下调与BTCC的发生、进展及其恶性特征有关，并且其表达水平与细胞的凋亡过程有关。如果能够通过药物或基因诱导促进Cx43的表达，恢复细胞的GJIC功能，抑制肿瘤细胞，将为膀胱移行细胞癌的诊治研究提供新的思路。

1 Krysko DV，Mussche S，Leybaert L，et al．Gap junctional communication and connexin43 expression in relation to apoptotic cell death and survival of granulosa cells［J］．J Histochem Cytochem，2004，52(9):1199－1207.

2 YamasakiH，Krutovskikh V，MesnilM，etal．Role of connexin(gap junction)genes in cell growth control and carcinogenesis［J］．C R Acad Sci III，1999，322:151－159.

3 Habermann H，Ray V，Habermann W，et al．Alterations in gap junction protein expression in human benign prostatic hyperplasia and prostate cancer［J］．JUrol，2002，167:655 －660.

4 Shao Q，Wang HL，Mclachlan E，et al．Down－regulation of Cx43 by retroviral delivery of small interfering RNA promotes an aggressive breast cancer cell phenotype ［J］．Cancer Res，2005，65(7):2705 －2711.

5 Wilgenbus KK，Kirkpatrick CJ，Knuechel R，et al．Experession of Cx26，Cx32，Cx43 gap junction proteins in normal and neoplastic human tissues［J］．Int JCancer，1992，51:522－529.

6 范松青，周鸣，向秋，等.细胞间隙连接蛋白在多种类型癌组织中的原位表达研究［J］．癌症，2003，22(7):686－690.

7 Klotz LO，Patak P，Ale－Aqha N，et al．2－Methyl－1，4－naphthoquinone，vitamin K3，decreases gap－junctional intercellular communication via activation of the epidermal growth factor receptor/extracellular signal－regulated kinase cascade ［J］．Cancer Res，2002，62:4922－4928.

8 Kang KS，Kang BC，Lee BJ，et al．Preventive effect of epicatechin and ginsenoside Rb2 on the inhibition of gap junctional intercellular communication by TPA and H2O2［J］．Cancer Lett，2000，152:97 －106.

9 Da Cruz Perez DE，Pires FR，Alves FA，et al．Salivary gland tumors in children and adolescents:a clinicopathologic and immunohistochemical study of fifty three cases ［J］．Int JPediatr Otorhinolaryngol，2004，68:895－902.

10 Bilim VN，Tomita Y，Kawasaki T，et al．Variable Bcl－2 phenotype in benign and malignant lesions of urothelium ［J］．Cancer Letters，1998，128:87－92.

11 Korkolopoulou P，Lazaris AC，Konstantinidou AE，et al．Differential expression of bcl－2 family proteins in bladder carcinomas relationship with apoptotic rate and survival［J］．Eur Urol，2002，41:274 －283.

12 Ogawa T，Hayashi T，Tokunou M，etal．Suberoylanilide hydroxamic acid enhances gap junctional intercellular communication via acetylation of histone containing connexin 43 gene locus［J］．Cancer Res，2005，65:9771－9778.

13 Krutovskikh VA，Piccoli C，Yamasaki H.Gap junction intercellular communication propagates cell death in cancerous cells［J］．Oncogene，2002，21:1989 －1999.