日本血吸虫未成熟虫卵的制备

熊 涛 长江大学长江中游湿地农业教育部工程研究中心,湖北荆州434025 长江大学生命科学学院,湖北荆州434025

万 灿,倪凤娥,张 枫 (长江大学长江中游湿地农业教育部工程研究中心,湖北荆州434025)

血吸虫病是由血吸虫寄生于人体引起的地方性寄生虫病。寄生于人体的血吸虫主要有3种:即流行于非洲北部的埃及血吸虫;流行于拉丁美洲及非洲中部的曼氏血吸虫以及流行于亚洲的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)[1-2]。在我国因只有日本血吸虫病流行,故通常将日本血吸虫病简称为血吸虫病。日本血吸虫病在我国长江流域和长江以南的13个省、直辖市、自治区严重流行,解放初期估计有患者上千万人,是我国危害最为严重的寄生虫病[3-4]。血吸虫也称裂体吸虫 (schistosoma),寄生在宿主静脉中的扁形动物。血吸虫寄生于多数脊椎动物,寄生人体的有 6种:曼森氏裂体吸虫(S.mansoni,即曼氏血吸虫)寄生在大、小肠静脉中,主要分布于非洲和南美洲北部[5-8]。虫卵随粪便排出。幼虫进入中间宿主螺体内,再通过皮肤回到终宿主人体内。寄生于人体的血吸虫在形态、生理和生活史等方面,有许多不同于其它人体寄生吸虫的地方,如血吸虫系雌雄异体;成虫在肠系膜静脉或膀胱静脉丛寄生,虫卵从粪或尿中排出,因虫种而异;尾蚴尾部分叉,在水中经皮肤侵入缩主;生活史中无雷蚴和囊蚴阶段等[9]。

日本血吸虫纯净虫卵的大量制备和纯化是对日本血吸虫及血吸虫病研究的重要一环,血吸虫虫卵抗原的制备及研究、血吸虫虫卵RNA和DNA的提取、血吸虫虫卵体外培养及血吸虫虫卵的发育过程或其影响因素的研究、建立动物的肺或肝脏组织血吸虫虫卵肉芽肿模型以及血吸虫病发病机制的研究等都涉及血吸虫虫卵的分离和纯化[10-11]。制备的纯净虫卵可为血吸虫病诊断、疫苗研制和新药研究等提供大量的实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

受试动物:采用4只健康普通杂种家兔,雌、雄随机,体重2.1～2.3kg,7～9月龄,购自宠物市场。

主要试剂有:0.25%胰蛋白酶溶液(中国医药集团上海化学试剂公司)、自制 PBS(pH7.2,1000ml溶液中含8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4,用HCl调pH,高压灭菌)、自制1%NaCl溶液。

主要仪器:低速大容量离心机DL-5-C(上海安亭科学仪器厂)、高速组织捣碎机DS-1(上海标本模型厂)、标准分样筛 (上虞市五四建材仪器厂)、显微镜 (Leica Microsystens lnc.)、超净工作台 (上海苏达实验仪器有限公司)、生化培养箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司)、调速离心机TGL-16G(上海安亭科学仪器厂)、冰箱 (新飞BCD-173K)、电子天平 (Made by Sartorius)、高压灭菌锅 (上海三申医疗器械有限公司)、50ml和1.5ml离心管。标准分样筛及所用容器,包括高速组织捣碎机的盛器在使用前均需121℃灭菌20min。

1.2 方法

(1)动物感染 将4只普通家兔 (雌、雄随机)每兔感染4500～5000条尾蚴,于感染后30d耳后静脉注射空气处死,于超净工作台中解剖,摘取其肝脏。

(2)匀浆前准备 从人工感染4500～5000条尾蚴30d后的兔中取出肝脏于消毒器皿中,除去胆管、血管及结缔组织,用消毒的4℃预冷的1%NaCl溶液洗净血污,将肝脏剪成小碎块。

(3)匀浆 在肝脏碎块中加入600ml 4℃预冷的1%NaCl溶液,一并倒入高速组织捣碎机中,以10000～12000r/min分3次匀浆,每次3min,间隔5min。捣碎完后,用4℃预冷的1%NaCl溶液稀释。

(4)分级分离 稀释后的匀浆先后用80、100、120、200目分样筛过滤,收集滤液于无菌容器中,滤渣重复用4℃预冷的1%NaCl溶液冲洗,直至滤渣经镜检观察,几乎没有血吸虫虫卵方可弃去滤渣,最后每只兔可收集滤液1500ml左右。将滤液立即倒入50ml离心管内,以3500r/min离心1min,弃去上液,下层沉淀反复用4℃预冷的1%NaCl溶液洗涤—中速低温离心—去上液,反复3次后,上液基本澄清,收集沉淀于50ml离心管中。

(5)消化 向收集好的沉淀中加入40ml 4℃预冷的0.25%胰蛋白酶溶液,于37℃生化培养箱中消化,在显微镜下观察,根据肝组织碎片的多少可适当改变消化时间。消化4h后,镜检可看到肝组织残片被消化为单个细胞。

(6)纯化 用PBS(pH7.2)稀释消化后的虫卵,经360目分样筛过滤,肝组织碎片及少数小的虫卵随液体流出,留在筛子上的虫卵用PBS(pH7.2)冲洗下来,并用260目分样筛过滤,进一步除去未消化完全的肝组织残片及实验过程中引入的漂浮杂质。将滤液转入50ml离心管中,4000r/min离心5min,去上清,用移液枪取少量管底虫卵于显微镜下观察,可见所获得的虫卵非常纯净。将其分装于1.5ml离心管中,12000r/min,离心30s,进一步去除虫卵中的水分,4只兔共获得纯净虫卵2.63ml,将其存入-20℃冰箱中备用。

2 结果与分析

感染4500～5000条尾蚴的兔,每只可收集0.66ml左右的纯净虫卵,在显微镜下 (10×40)可见背景干净,虫卵内部结构及整个外部轮廓清晰、完整,并可见获得毛蚴从卵壳中涌出 (图1),整个分离过程耗时较短,因此,对虫卵的活力影响较小,毛蚴孵化率可达80%以上 (8h,27℃)。

3 讨论

现有获得血吸虫虫卵及其纯化的数种方法均有一定缺陷,如Coker等[12]将感染动物处死后置于冰箱中冷藏1～2d再处理肝脏,这样能有效减少后续分离过程中的肝组织碎片,有利于提高虫卵纯度,但延长了虫卵分离的时间,难以保持虫卵内物质活性。徐克继等[13]提纯虫卵的方法,耗时长,且纯化后虫卵仍含有不少肝组织碎片。刘兰英等的提纯法获得的虫卵相对纯净,但纯化过程较繁琐,且纯度较差,每个高倍视野下仍可见肝细胞。周松华等[14]提纯法虽然虫卵分离得较好,但破壳卵多,损失大,对虫卵抗原的活性有影响。目前获取无菌日本血吸虫虫卵的方法主要是在体外无菌条件下培养成虫而获得。Rodrigues等[15]所述的用低速及超声波处理的虫卵,虽然虫卵纯化效果较好,但损失较多,且活力几乎丧失。杨静等[16]发现841和891 2种培养基上培养的血吸虫,随着培养时间的增加,成虫产卵畸卵率明显升高。在体外培养到第11～14天,841和 891畸卵率分别为 (80.3±12.7)%及 (58.9±9.2)%。培养第15天,841和891培养基的成熟期虫卵分别为 (28.4±8.3)%及 (30.1±7.8)%;死卵分别为 (55.5±7.8)%及 (51.9±8.3)%。所以现行各种血吸虫虫卵收集方法或难以达到较高纯度,或获得的虫卵活力低,致畸率及致死率较高。本研究通过肝脏匀浆反复过筛以除去肝组织碎片,可节省时间,提高工作效率。作者认为虫卵纯化的关键在于先将大于虫卵体积的肝脏碎块进行消化,然后加预冷的PBS(pH7.2)稀释,经360目/in分样筛过滤,可除去肝细胞碎片,残留物经260目/in分样筛过滤,又可除去大的碎片,最后可获得纯净的虫卵。此外,过筛时纤维残渣不要轻易丢弃,可采用反复洗涤、过滤、离心的方法,进一步将其中的虫卵分离出来,以提高虫卵的收获率。本方法具有操作简便、分离速度快、获虫卵数量多、纯度高、费用低等优点,由于整个分离纯化过程在数小时内完成,故对虫卵活性影响较小。本法制备的纯净虫卵可为血吸虫病诊断、疫苗研制和新药研究等提供大量的实验材料。

图1 血吸虫未成熟虫卵显微镜观察图

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