胰腺癌细胞DPYD、MTHFR基因单核苷酸多态性分析

张孝平，张文静，陈宝安* ，柏志斌，冯继峰，程 璐

(1东南大学医学院附属中大医院，南京210009;2东南大学医学院肿瘤系;3江苏省肿瘤研究所;4东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室)

胰腺癌(PC)临床发病隐匿，发展迅速，预后极差。据统计，2009年美国新增PC患者42 470例，83%的患者在1年内死亡［1］。目前，手术切除是PC唯一可治愈性方法，但85%的患者就诊时已属晚期或发生远处转移，手术切除率为10% ～15%。因此，化疗在PC综合治疗中占有重要地位。近年来，尽管PC的一线化疗方案多以吉西他滨为基础，但氟尿嘧啶类药物5-FU、卡培他滨等仍是PC化疗中最常用药物。二氢嘧啶脱氢酶(DPD)及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是氟尿嘧啶类药物体内代谢的关键酶，为探讨PC细胞株中二氢嘧啶脱氢酶(DPYD)基因、MTHFR基因的单核苷酸多态性(SNPs)位点基因型，2010年12月～2011年8月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 新生小牛血清(杭州四季青公司)，RPMI-1640液(美国 Gibco公司)，0．25%胰酶(Sigma公司)，DNA 提取试剂盒、dNTP、Taq DNA 酶(德国Qiagen公司)。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养及基因组DNA提取 PC细胞株SW1990、PANC-1、CFPAC由东南大学医学院实验室传代培养。将细胞接种于10%小牛血清RPMI-1640培养液，置37℃、5%CO2、95%湿度培养箱中培养，贴壁细胞用0．25%胰蛋白酶消化传代。采用德国Qiagen公司产试剂盒提取基因组DNA。

1．2．2 PCR扩增及产物纯化 采用Assay Designer软件设计PCR引物，PCR引物由上海邃志公司合成，PCR引物序列(略)。PCR反应体系中含有5 ng模板 DNA 的 1 μl、水 0．95 μl、PCR 缓冲液 0．625 μl、2．5 mmol/L 的 dNTP 1 μl、25 mmol/L 的 MgCl20．325 μl、PCR 引物 1 μl及 HotStar Taq 酶 0．1 μl。PCR反应条件为:94℃预变性15 min，94℃变性20 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行45个循环;最后72℃延伸3 min。反应体系包括1．53 μl水、0．17 μl SAP 缓冲液、0．3 U 碱性磷酸酶;该反应在37℃进行40 min，然后85℃、5 min使该酶失活。碱性磷酸酶处理后，对SNPs行单碱基延伸:94℃预变性30 s，94℃变性5 s，52℃退火5 s，80℃延伸5 s，共40个循环;最后72℃延伸3 min。

1．2．3 样本分析 采用美国 Sequenom公司产MassARRAY系统，将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP上，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行分析;结果由MassARRAY RT软件读取并完成基因分型分析。

2 结果

2．1 PC细胞株DPYD基因的SNPs位点基因型SW1990、PANC-1、CFPACPC细胞株 DPYD基因的rs1801159位点基因型均为A/A纯合子，rs1801160位点基因型均为G/G。CFPAC细胞株DPYD基因的rs17376848位点基因型为A/G，PANC-1、SW1990细胞株的rs17376848位点为A/A纯合子。

2．2 PC细胞株MTHFR基因的SNPs位点基因型 PANC-1、CFPACPC细胞株 MTHFR基因的rs1801131位点基因型为A/C杂合子，rs1801133位点基因型为C/C;SW1990细胞株MTHFR基因的rs1801131位点基因型为A/A纯合子，rs1801133位点基因型为T/T纯合子;三株细胞MTHFR基因的rs2274976基因型位点均为G/G纯合子。

3 讨论

在肿瘤化疗中，相同病理类型、分期及方案化疗患者的疗效、生存期和毒副反应有时截然不同，即“同药不同效”现象。这种现象与抗肿瘤药物在肿瘤患者的药动学和药物效应毒性个体差异有关［2］，相关基因的SNPs是其产生的主要原因。药物代谢酶参与多种药物的代谢活化或解毒，其酶基因多态性对肿瘤化疗反应及预后的影响正引起越来越多学者的关注。

DPD是5-FU代谢失活的限速酶，约80%的药物在肝脏中经DPD分解代谢为无活性产物二氢氟尿嘧啶。DPD由DPYD编码产生，DPYD碱基突变可能引起DPD结构及活性改变。目前发现，至少40余种突变与DPD活性下降及氟化嘧啶类药物毒性反应有关。Saif等［3］对1例应用5-FU后发生严重血液及神经系统毒副作用的晚期PC患者进行DPYD检测，发现DPYD IVS14+1 G＞A及DPYD*2A是引起DPD缺乏的最常见多态性。Shahrokni等［4］报道1例与5-FU治疗相关的心脏毒副反应的PC患者，认为DPYD p453L(1358 C＞T)可能是5-FU为基础化疗发生严重毒副作用的潜在因素。

MTHFR是叶酸代谢的关键酶，其基因多态性与叶酸浓度及其在细胞内的分布有关，进而影响肿瘤细胞生长。目前发现，C677T、A1298C是常见与MTHFR活性相关的 SNPs。Suzuki等［5］研究认为，包括MTHFR在内的一碳代谢相关基因多态性可改变饮酒与PC发生危险性的相关性。另有研究发现，MTHFR C677T与 PC发病危险性相关［6］。此外，MTHFR可将还原型叶酸转变为5-甲基四氢叶酸，削弱5-FU的抗肿瘤作用，影响患者对化疗的敏感性。

MALDI-TOFMS是近年生物大分子检测领域开展的新技术，目前，国外已利用该技术的高精确度和灵敏度进行基因组SNPs检测［7］;有关研究检测的DPYD基因的三个SNPs位点［A1764C(rs1801159)、G2331A(rs1801160)、T2033A(rs17376848)］及MTHFR基因的三个 SNPs位点［G1965A(rs2274976)、A1515C(rs1801131)及 C894T(rs1801133)］均为基因编码区的错义SNPs，其碱基突变可导致相应的氨基酸改变，可能引起DPD及MTHFR活性改变，影响氟尿嘧啶类药物的体内代谢，且与氟尿嘧啶类药物的疗效及毒副反应相关。本研究采用MALDI-TOFMS对三个PC细胞株的SNPs进行检测，发现PANC-1、CFPAC及SW1990细胞株的DPYD基因rs1801159、rs1801160位点基因型及MTHFR基因的rs2274976位点基因型相同，其余SNPs位点基因型均不完全相同。

总之，我们认为检测PC细胞株中DPYD基因、MTHFR基因的SNPs位点基因型，是肿瘤细胞耐药及耐药逆转研究的基础，可应用于临床预测氟嘧啶类药物的疗效及毒副反应，使患者在选用最佳药物方案、剂量及最大限度地降低药物毒副反应方面受益。因单一药物基因多态性对肿瘤化疗反应的作用相对较小，故需结合临床更大的标本量进行更深入的研究。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al．Cancer statistics［J］．CA Cancer J Clin，2007，57(1):43-66．

［2］Elsayad YA，Sausville EA．Selected novel anticancer treatments targeting cell signalling protein［J］．Oncologist，2001，6(6):517-537．

［3］Saif MW，Ezzeldin H，Vance K，et al．DPYD*2A mutation:the most common mutation associated with DPD deficiency［J］．Cancer Chemother Pharmacol，2007，60(4):503-507．

［4］Shahrokni A，Rajebi MR，Harold L，et al．Cardiotoxicity of 5-fluorouracil and capecitabine in a pancreatic cancer patient with a novel mutation in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene［J］．JOP，2009，10(2):215-220．

［5］Suzuki T，Matsuo K，Sawaki A，et al．Alcohol drinking and onecarbon metabolism-related gene polymorphisms on pancreatic cancer risk［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(10):2742-2747．

［6］Nisevic I，Dinic J，Nikolic A，et al．MTHFR C677T polymorphism in chronic pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma［J］．Cell Biochem Funct，2008，26(6):659-663．

［7］Bray MS，Boerwinkle E，Doris PA．High-throughput multiplex SNP genotyping with MALDI-TOF mass spectrometry:problems and promise［J］．Hum Mutat，2001，17(4):296-304．