体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞的实验研究

阮中宝，杨向军，陈各才，朱 莉，李 伟，杨 兵，欧阳溪，潘少辉

(1苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006;2泰州市人民医院;3江苏省北科生物科技有限公司)

间充质干细胞(MSC)具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，在一定条件下能分化成为各种功能细胞，可被应用于多种疾病的治疗［1～3］。5-氮胞苷(5-aza)是胞嘧啶核苷的类似物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化，从而参与激活表型特异性基因。2011年6～12月，本研究通过对人脐带源间充质干细胞(hUC MSCs)体外分离、培养，并采用5-aza诱导，旨在研究其在体外诱导分化为心肌细胞的可行性。

1 材料与方法

1．1 材料 5份脐带标本来源于泰州市人民医院2010年9月份产科足月顺产或剖宫产胎儿。主要试剂和仪器:DMEM/F12培养基(GIBCO，NVF0274);通用型SP Kit广谱免疫组化试剂盒、DAB染色试剂盒、Anti-cTnI抗体(北京博奥森生物技术有限公司);倒置显微镜(日本Olympus)。SP-9000:生物素标记山羊抗兔、大鼠和豚鼠IgG;SP-9001:生物素标记山羊抗兔IgG;SP-9002:生物素标记山羊抗小鼠IgG。

1．2 实验方法

1．2．1 hUC MSCs的分离和培养 取采集24 h内的新鲜脐带至培养平皿中，将脐带沿结扎内侧剪断，取中间部分。加入适量的生理盐水，洗涤脐带至表面干净无血，将脐带移至另一培养平皿中;将脐带剪成2～3 cm的小段，沿静脉血管剪开，将静脉血管壁和动脉血管剥离;将华通胶剥离，用组织剪剪碎至1 mm3大小，接种于T75培养瓶中，培养液为10 ml含10%FBS的DMEM/F12，倒置显微镜观察细胞形态。待细胞60%融合后，1∶3传代。传至3代后，部分细胞冷冻保存，部分细胞用于实验。整个过程在无菌条件下进行。

1．2．2 hUC MSCs的诱导 P3代细胞常规消化收集，用PBS清洗2次，调整细胞密度为2×104/ml，重新接种于24孔培养板中，培养24 h待细胞贴壁(约10%融合)，培养液中加入终浓度为10 μmol/L的5-aza培养24 h，吸去含5-aza的培养液，用PBS洗涤2次，改用完全培养液继续培养，设对照组5-aza的浓度为0 μmol/L，其他操作相同。持续培养4周，每3 d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞生长和形态学的变化，分别于诱导前和诱导后1、2、3、4周进行拍照。

1．2．3 hUC MSCs免疫组化鉴定 将载有诱导分化4周后的MSC和对照组MSC的盖玻片用PBS液轻轻洗涤浸泡5 min，按试剂盒说明书操作;显微镜下拍照，细胞质中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。

2 结果

2．1 诱导前后hUC MSCs形态变化 诱导前为典型的梭形，核/质比例高，胞质量少而均匀，无颗粒、细丝样结构，核内可见明显核仁，细胞呈同心圆或漩涡样生长;处理24 h后，仅有少量细胞死亡;诱导后1～2周，细胞形态出现变化。细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形;3～4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较同期未经诱导组明显减少，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构、且多聚集于细胞核周围，大约30%左右细胞胞质内可见细丝样结构。对照组未见肌管状细胞出现。

2．2 hUC MSCs免疫组化鉴定结果 经免疫组化试剂鉴定，诱导组细胞均能着浅褐色，即cTnI表达为阳性，对照组细胞未能着色，即cTnI表达为阴性。

3 讨论

最近研究表明，应用MSC移植有可能取代受损心肌细胞并建立新的血管来改善供血及心功能，从而为心肌梗死的治疗开辟了一条崭新途径。

目前MSC的主要来源为成人骨髓和胎儿脐带血，但成人骨髓MSC数量级增殖分化潜能随供者年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且采集需行骨髓穿刺，来源受到限制［4］。脐带来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，无伦理道德问题的限制，且细胞增殖、分化能力较强，适合体外大规模培养。因此，hUC MSCs有望成为骨髓MSC的理想替代来源。

目前用于脐带源间充质干细胞的培养组织主要是脐带 Wharton胶和脐静脉［5，6］，获取方法主要有酶消化法、组织块法等。本研究初步建立了脐带Wharton胶组织块法培养和用5-aza诱导hUC MSCs体外定向分化为心肌细胞的实验体系，5-aza诱导3～4周，相邻hUC MSCs细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，大约30%hUC MSCs细胞质内可见细丝样结构。肌钙蛋白是心肌细胞中的一种调节蛋白，参与调节收缩蛋白的舒缩活动，由3个亚单位组成，cTnI是其中之一，hUC MSCs经5-aza诱导分化后，cTnI免疫组化染色阳性，与文献［7］报道一致，提示分化后的细胞已经合成了心肌所特有的物质，表明hUC MSCs在体外诱导分化为心肌细胞，为今后细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。

［1］Si YL，Zhao YL，Hao HJ，et al．MSCs:biological characteristics，clinical applications and their outstanding concerns［J］．Ageing Research Reviews，2011，10(1):93-103．

［2］Parekkadan B，Milwid JM．Mesenchymal stem cells as therapeutics［J］．Annual Review of Biomedical Engineering，2010，12(1):87-117．

［3］Motaln H，Schichor C，Lah TT．Human mesenchymal stem cells and their use in cell-based therapies［J］．Cancer，2010，116(11):2519-2530．

［4］Yu JM，Wu X，Gimble JM，et al．Age-related changes in mesenchymal stem cells derived from rhesus macaque bone marrow［J］．Aging cell，2011，10(1):66-79．

［5］Troyer DL，Weiss ML．Wharton＇s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population［J］．Stem Cells，2008，26(3):591-599．

［6］Kestendjieva S，Kyurkchiev D，Tsvetkova G，et al．Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord［J］．Cell Biol Int，2008，32(7):724-732．

［7］ Roura S，Farre J，Galvez C，et al．Umbilical cord blood-derived stem cells spontaneously express cardiomyogenic traits［J］．Transplantation Proceedings，2007，39(7):2434-2437．