组蛋白去乙酰化酶6与自噬

温 迪，于秀军，2，郭艳苏，2*

(1河北医科大学第二医院，石家庄050000;2河北省神经病学重点实验室)

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的主要功能是去除组蛋白N-末端的赖氨酸残基乙酰基部分，使染色质变得致密，从而抑制基因转录。但是有些HDACs，例如HDAC6，也能够影响细胞内非组蛋白的功能。研究显示，HDAC6参与细胞内自噬的降解过程［1］，自噬是包括人在内的真核生物共有的一种高度进化保守机制，调节细胞质长寿命蛋白、损伤的细胞器以及异常蛋白聚集物的更新和重复利用。研究HDAC6与自噬的关系将为神经变性疾病的治疗提供新的线索。

1 HDAC家族的分类及定位

HDAC是1个大的酶家族，其成员目前已知有18个不同的亚型，根据种系发生和系列同源性分为4大类:Ⅰ(HDAC 1、2、3和8)、Ⅱ(HDAC 4、5、6、7、9和10)、Ⅲ(SIRT1～SIRT7)和Ⅳ(HDAC11)。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ为经典家族，是Zn2+-依赖性的HDAC。Ⅰ类HDACs主要与酵母的转录因子yRPD3相互作用，在不同的发育阶段、不同的组织和细胞类型中广泛表达，主要定位在细胞核［2］。Ⅱ类HDACs具有组织和时期特异性，HDAC6主要定位于细胞质，而HDAC 4、5、7和9主要穿梭于细胞核与细胞质之间，只在部分组织细胞中表达。Ⅲ类HDACs属于Sirtuin家族，是酵母SIR2蛋白在哺乳动物中的相似物，它不使哺乳动物的组蛋白去乙酰化，不属于经典的HDACs，是NAD+-依赖的去乙酰化酶［3］。

2 HDAC6的分子结构及作用

HDAC6基因定位于X染色体p11.22-23区带，约21 923 bp，由位于41～677 bp间的28个外显子编码。从蛋白质结构来讲，HDAC6含有1 216个氨基酸，是目前发现的人类最大的蛋白质。HDAC6独特地拥有两个高度同源的催化区域:一个起始于第215位氨基酸，另一个起始于第610位，而且均含有一个与泛素结合的富含半胱氨酸和组氨酸的锌指结构区域。C-末端的锌指结构区既能与泛素化的错误折叠蛋白结合，又能与肌动蛋白结合。体外去乙酰基活性位点主要位于C'端第二催化区域，即H611A。体内HDAC6主要分布于胞质、核周结构和细胞的生长前沿区，与包含p150的动力复合物相互作用。HDAC6在心、肝、肾、脑、胰腺等脏器中高表达，是一种胞内酶，具有泛素结合功能和去乙酰化酶活性，它与底物［α-微管蛋白、HSP90和cortactin］相互作用并使之去乙酰化。通过这些相互作用，HDAC6调节许多重要的生物过程，包括细胞迁移、微管稳定性、胞内运输、免疫突触形成以及错误折叠蛋白的降解［4］。

3 自噬

自噬能清除细胞内过多或异常的蛋白质、细胞器，甚至病原微生物，不仅有利于维持细胞稳态，也促进氨基酸等的再循环，为多种生化进程提供底物或原料。根据自噬底物进入溶酶体的途径不同，自噬分为:①巨自噬:细胞质中可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被囊泡样双层膜结构的自噬体包裹后，自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，与之融合成自噬溶酶体进行降解;②微自噬:溶酶体膜自身发生内陷，直接将底物摄入溶酶体进行降解;③分子伴侣介导的自噬:分子伴侣Hsc-70识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合，形成分子伴侣—底物复合体，然后与溶酶体相关膜蛋白2A型受体结合进入溶酶体降解［5］。自噬主要由自噬相关基因(Atg)编码的蛋白完成。从低等生物到高等生物，大部分Atg为高度保守性。Atg5和Atg6(beclin1)被证明是巨自噬和微自噬的必要基因标志，而溶酶体受体则被认为是分子伴侣介导的自噬标志。LC3是酵母 Atg8(Aut7/ Apg8)在哺乳动物的同系物，可作为自噬体的标记蛋白。

基础的质量控制性自噬是不依赖于营养的“基本的”自噬，主要功能是通过选择性地对蛋白质聚集体和损坏的细胞器(包括线粒体)的处理，加强细胞内的质量控制，对蛋白和细胞器的回收利用很重要。特异性地去除小鼠神经元的Atg5和Atg7，导致了泛素阳性的蛋白聚集以及神经元的进一步丢失，充分阐释了自噬的这一活性。饥饿和应激诱导的自噬非选择性地降解细胞质内容物以及细胞器，为细胞提供生存的大分子和能量，促进细胞存活，超出安全范围则导致细胞死亡。研究显示，尽管质量控制自噬和饥饿诱导的自噬共享依赖于溶酶体降解细胞质组分的共同Atg机制，但二者在功能、本质和底物特异性上是不同的［6］。

4 HDAC6与聚集体的形成

错误折叠及聚集的蛋白是许多年龄相关或遗传性神经变性疾病共有的病理学标志，包括阿尔茨海默病、帕金森疾病、肌萎缩侧索硬化和多谷氨酰胺疾病等［7］。错误折叠蛋白不仅没有功能，还能够形成干扰细胞功能的聚集物。因此，错误折叠蛋白被严密监督、处理以及降解，以防止在细胞内堆积。

通常情况下错误折叠蛋白被泛素化从而被蛋白酶体降解。当蛋白酶体活性被抑制时错误折叠蛋白聚集形成聚集体，聚集体的形成是细胞保护性反应的一部分，是清除细胞内毒性的错误折叠蛋白的关键，通常和神经变性疾病中细胞的死亡相关。聚集体的形成有两种功能:将错误折叠蛋白浓集形成聚集体从细胞质中去除，阻止广泛的细胞内毒性反应;通过微管组织中心为靶点的蛋白分解装置(包括自噬)，有效地降解毒性蛋白。

HDAC6通过去乙酰化酶活性和泛素结合活性参与聚集体的形成，聚集体分为泛素阳性和泛素阴性，HDAC6通过C-末端锌指结构区选择性地和泛素阳性的聚集体结合。HDAC6和动力蛋白复合物的组分p150相关，通过邻近第二催化区域的第65位氨基酸多肽与动力蛋白结合，将泛素阳性的蛋白募集至动力蛋白，形成泛素阳性蛋白-HDAC6-动力蛋白三聚体，沿着微管转运至微管组织中心，中间丝细胞骨架包绕三聚体形成聚集体［8］。实验表明，在敲除HDAC6的细胞中，错误折叠的蛋白聚集物不能形成聚集体;用MG-132诱导聚集体形成，再引入无催化活性或泛素结合缺陷的突变体HDAC6，都不能形成聚集体，但是可以在细胞质中形成小的泛素化微团聚体，而蛋白聚集物则不能转运至微管组织中心被降解［6］。这些结果说明聚集体的形成需要HDAC6，并且依赖于它的去乙酰化酶活性和泛素结合活性。

在热休克反应通路中，HDAC6通过泛素结合活性调节HSP90-HSF1复合物的分离，正常情况下，HSP90维持HSF1处于无活性状态。在热休克途径或蛋白酶体抑制的情况下，HDAC6的泛素结合能力将蛋白酶体功能障碍的信号传递给HSP90-HSF1复合物，诱导HSF1转录因子的释放和活化，依次激活应答的HSP基因，导致主要的分子伴侣HSP70和HSP27聚集，对错误折叠蛋白聚集物作出反应。HSP降低了错误折叠蛋白的毒性，增加细胞内分子伴侣的表达，使蛋白分解或者再折叠转运至蛋白酶体被降解［9］。

p97/VCP是AAA ATP酶家族的分子伴侣，与泛素蛋白酶体途径相关，具有分离酶活性，可以使HSP90-HSF1复合物分离。研究显示p97/VCP是HDAC6的配偶体，HDAC6的泛素结合活性可以使 HDAC6-p97/VCP复合物分离［10］。HDAC6和p97/VCP之间的平衡决定了泛素化的蛋白是被降解还是形成聚集体，因为p97/VCP促进了蛋白酶体介导的蛋白质降解，而HDAC6促进了泛素化蛋白聚集形成聚集体。然而，在p97/VCP突变细胞中聚集体形成受损，提示HDAC6和p97/VCP在聚集体形成中的相互联系。p97/VCP参与恢复活化的HDAC6以及再形成HSP90-HSF1复合物，可以推测p97/VCP对于 HDAC6的重复利用起着至关重要作用［11］。

5 HDAC6与聚集体的降解即自噬过程

聚集的蛋白具有细胞毒性，有效地处理错误折叠的蛋白对细胞活力十分必要，这一过程需要三个相互联系的通路:分子伴侣机制辅助蛋白折叠;蛋白酶体途径降解错误折叠的蛋白;聚集体途径将毒性蛋白分离以及传递给自噬细胞而清除。蛋白聚集物的堆积通过阻塞蛋白酶体或其他间接的机制抑制蛋白酶体活性，导致聚集的错误折叠蛋白进一步堆积。事实上不能降解错误折叠和聚集的蛋白对许多神经变性疾病的神经细胞死亡起主导因素［12］。

自噬体包含的HDAC6产生信号募集自噬组分，同时自噬体外的HDAC6与动力蛋白、Atg8和Atg12之间存在相互联系。但是HDAC6并不是唯一的调节自噬募集的蛋白，最近研究表明，另一种泛素结合蛋白p62也参与调节自噬体向蛋白聚合物的募集反应，p62和自噬蛋白LC3结合，这一过程是不依赖于 HDAC6的［10］。质量控制的自噬需要HDAC6，但是在饥饿诱导的自噬中HDAC6却是可有可无的，这一发现显示自噬的调节是有差别的。在自噬底物中HDAC6招募并且激活了一个肌动蛋白重塑因子cortactin，HDAC6为泛素化蛋白聚集体补充cortactin，使动力蛋白重塑，从而促进了融合事件［8］，表明质量控制的自噬包括微管依赖的运输和肌动蛋白依赖的融合。在两个过程中，HDAC6起着重要作用，HDAC6和p62独立地识别并且结合蛋白聚集体或其他质量控制自噬底物的特异泛素成分，它们招募并装配自噬的必需成分，包括自噬体、溶酶体和肌动蛋白网状结构。通过从底物中浓缩自噬的成分，刺激自噬体和溶酶体的融合，激活质量控制的自噬，特异和高效地完成蛋白聚集体和损伤细胞器的清除。

由于自噬体缺乏内在酶活性，因此自噬体与溶酶体的融合对于有效的自噬是十分关键的。使用pH敏感的mCherry-GFP-LC3报告基因来检测融合效率，结果表明在正常营养条件下有效的自噬体和溶酶体的融合需要HDAC6。为了获得更多HDAC6直接调节自噬体和溶酶体融合的证据，进一步在体外测定分析它们的融合效率。尽管体外测定不能够区分HDAC6敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)自噬体和溶酶体的融合缺陷是否由于对接、圈合或自身膜融合的不足，但是进一步提供了自噬体和溶酶体有效融合需要HDAC6的证据［6］。

自噬体和溶酶体的融合缺陷预示着自噬体的聚集。体内和体外的融合测定和形态测定分析均支持HDAC6在自噬体和溶酶体的融合中起着重要作用，通过自噬流量分析和p62的聚集测定进一步证实了这一结论。在HDAC6敲除的MEFS中，溶酶体融合缺陷导致自噬体集聚。在阿尔茨海默病患者营养障碍的轴突和额颞叶痴呆小鼠模型也发现了相似的异常自噬结构的显著聚集［6］。研究发现，敲除HDAC6的小鼠和敲除HDAC6的转基因果蝇均出现泛素阳性的聚集体，产生了自发的神经变性。然而，缺乏HDAC6并不影响自噬的激活，而是使自噬体—溶酶体融合受损。这一发现强调了自噬体—溶酶体融合缺陷和神经变性疾病进展的因果关系。如果这一假说是正确的，使用融合促进剂促进有效的自噬可能是治疗神经变性疾病最有效的方法［13］。

6 小结

HDAC6是一种罕见的去乙酰化酶，以细胞质定位、泛素结合能力、对动力蛋白和肌动蛋白细胞骨架产生影响为特征。此外，HDAC6能促进错误折叠蛋白的降解，故选择性地抑制HDAC6可以严重地破坏细胞处理错误折叠蛋白的能力，导致细胞内的蛋白“垃圾”迅速积累，进而诱发细胞凋亡。如果在神经变性疾病中，蛋白聚集物的毒性是神经元功能障碍以及死亡的基础，通过增强自噬以清除蛋白聚集物将是这一疾病合理的治疗方法。雷帕霉素的抗神经变性活性为这一观点提供了证据［13］。Nixon等报道在阿尔茨海默病患者脑组织中，发现不正常、非成熟的自噬体堆积。据此推测患者体内自噬体和溶酶体的融合可能受损。同样，自噬体与溶酶体融合缺陷可能与CHMP2B突变引起的家族性额颞叶痴呆有关。自噬体和溶酶体融合缺陷在神经变性疾病中的普遍性可能为探索有效治疗方法提供潜在的靶点，而HDAC6直接调节自噬体和溶酶体融合。试想，联合应用自噬激活剂和融合助催化剂可能会更有效地清除蛋白聚集物，为神经变性疾病提供新的治疗方法［6］。

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