乳腺癌干细胞研究进展

王俊艳综述 魏素菊审校

随着人们对乳腺癌发生、发展机制的深入研究，乳腺癌干细胞日益受到研究者们的重视。研究表明，乳腺癌干细胞是乳腺癌组织中极少数具自我更新和多向分化能力的细胞,与乳腺癌的发生发展密切相关。这些细胞具有化疗、放疗及缺氧抵抗性，同时具有高致瘤性、高侵袭转移性，在乳腺癌的发生﹑发展乃至转移﹑复发中起着极其重要作用。本文对乳腺癌干细胞在乳腺癌研究及治疗中的最新进展作一综述。

1 乳腺癌干细胞的鉴定和分离

以往的研究证实肿瘤干细胞应具备以下特性[1]:①少量乃至单个细胞即可在免疫缺陷鼠中形成新的肿瘤；②所生成的子代肿瘤具有异质性,既包含癌干细胞也包含一般癌细胞;③子代肿瘤需包含“源肿瘤”所有表型及遗传特征。

1.1 ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、Lin-细胞

2003年AI-Hajj等[2]将ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、L in-细胞注入到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠NOD /SC ID体内,12周内小鼠均出现肿瘤,而接种CD44- 或CD24+细胞的小鼠则少有肿瘤生长。生成的肿瘤细胞经分离再接种到小鼠乳房脂肪垫中,未分类细胞需接种5×104个才能形成肿瘤,而ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、Lin- 细胞只需接种1 ×103个即能100％形成肿瘤,这说明表达ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、L in- 表面标记的细胞亚群在乳腺癌中起着干细胞样作用。Ponti等[3]体外培养Oct4+及CD44+/CD24- 的人乳腺癌细胞,可产生分别具有腔上皮与肌上皮标记的2种癌细胞后代。Gabriella等[4]发现CD44+/CD24- 细胞在基底样乳腺癌和BRCA1遗传性乳腺癌中常见,其中94％遗传性乳腺癌含有 CD44+/ CD24 - 细胞,可见该群细胞在乳腺癌的发生中发挥着干细胞样作用。

1.2 乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)

ALDH 是细胞内的一组同工酶,在干细胞分化早期起着使视黄醇氧化成视黄酸的作用,ALDH1是ALDH家族的主要成员[5]。Ginestier等[6]利用ALDEFLOUR试剂检测细胞内ALDH活性，结果发现在乳腺组织的正常细胞以及癌细胞中ALDEF- LOUR阳性细胞均具有类似干细胞的自我更新和多向分化能力,而阴性细胞则不然。500个ALDEFLOUR 阳性乳腺癌细胞异种移植到去除乳腺的NOD /SCID 小鼠乳房脂肪垫中,就能形成肿瘤,而且能够分化形成ALDEFLOUR 阴性细胞。ALDEFLOUR 阳性细胞群和CD44+ /CD24- /Lin- 细胞群有部分重叠,至少20 个表型为CD44+ /CD24- /Lin- /ALDEFLOUR阳性细胞即能形成肿瘤。Charafe-Jauffret等[7]利用相同方法分离和标记出ALDEFL OUR阳性乳腺癌细胞株,将其异种移植到NOD /SCID小鼠中可以形成肿瘤,而且由ALDEFLOUR阳性细胞形成的肿瘤中ALDEFLOUR阳性细胞与ALDEFLOUR阴性细胞的比例与其在细胞株中的比例相似。此外,在造血细胞、胰腺癌和肺癌等多种组织中ALDH1高表达[ 8，9 ],ALDH1有望成为分离和鉴别多种干细胞的共同标志。

1.3 侧群细胞( sidepopulation,SP)

Hoechst33342 是DNA 增补性染料,能结合DNA的AT丰富系列的小沟处,干细胞及肿瘤干细胞因带有ABC转运蛋白而能将染料泵出细胞,经过荧光活化细胞分选系统( fluorescence activated cell sorter,FACS)的分析,将不被染色或低染色的肿瘤干细胞筛选出来,所分选出来的染色暗淡的细胞被称为侧亚群细胞,故又称为侧群细胞分选法。Patrawala等[10 ]将从人乳腺癌细胞系MCF-7中分离得到的SP细胞移植到NOD /SC ID小鼠,移植1000个SP细胞时,17％的小鼠形成肿瘤;移植1×104个SP细胞时50％的小鼠形成肿瘤,肿瘤形成的潜伏期随着移植SP细胞数量的增多而缩短,机制可能与SP细胞高表达Notch21和β2catenin分子有关。同时SP亚群可传代并生成其他非SP细胞,显示其具有自我更新和多向分化能力,提示有肿瘤干细胞特性。Engelmann等[11]发现MCF-7乳腺癌细胞中大多数SP细胞表型为CD44+ /CD24- / low；77.8％的SP细胞表达MUC1 ,因此以MUC1肿瘤抗原为治疗靶标可以消除肿瘤干细胞,为乳腺癌的治疗提供新的方案。

1.4 乳腺球(mammospheres)

乳腺上皮细胞悬浮培养时有一小群细胞可在不贴壁条件下形成一些漂浮的球形克隆,称乳腺球(mammospheres)。Ponti等[3]利用此方法从乳腺癌细胞中制备乳腺球,发现其中大部分细胞表达CD44+CD24-表型。与乳腺癌细胞相比,千倍稀释的乳腺球仍可在小鼠中形成肿瘤。这些乳腺球经酶分解后,10％～20％的细胞即可形成第2代乳腺球,其后培养传承40代,证明其具有自我更新能力,是一群富含肿瘤干细胞的细胞。

1.5 标记滞留细胞

溴脱氧尿嘧啶核苷( bromodeoxyuridine,BrdU)是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入到S期细胞单链DNA核苷酸序列中替代胸腺嘧啶。BrdU在细胞培养过程中或经活体注射加入后,利用抗BrdU单克隆抗体进行化学染色,显示增殖细胞。如果细胞迅速分裂,BrdU就会因为被稀释而检测不到；如果细胞分裂缓慢,就能被检测到,这种细胞被称为标记滞留细胞,故该方法可以用来鉴别和定位肿瘤干细胞[12]。但乳腺癌干细胞周期似乎不断循环,而且并不是所有的干细胞都具有滞留标记,滞留标记的细胞并不一定是干细胞。因此,在乳腺癌干细胞循环周期尚未探明之前,该标志物的使用有待于进一步研究。

然而,细胞表型仅仅是鉴定和分离细胞的标记和手段,并不等于说CD44+CD24-/low ESA+Lin-的乳腺癌细胞就是乳腺癌干细胞。Al-Hajj等[2]的研究仅说明CD44+CD24-/lowESA+Lin-的细胞中富含乳腺癌干细胞。因此,欲通过细胞表面标记或特殊培养方法来鉴定和分离完全的乳腺癌干细胞尚需更多的研究和探索。

2 乳腺癌干细胞与肿瘤的侵袭、转移和预后

2.1 乳腺癌干细胞与肿瘤的侵袭、转移

Sheridan等[13]研究了13种乳腺癌细胞系中CD44+/CD24-细胞亚群与肿瘤侵袭、归巢和转移的关系,发现在CD44+/CD24-比例较高的细胞系中,与侵袭相关的基因和蛋白(IL-6、IL-8、IL-1α和UPA)的表达明显高于CD44+/CD24-比例较低的细胞系。此研究表明,表达CD44+/CD24- 的乳腺癌细胞的含量与乳腺癌的浸润和转移呈正相关。Mumcuoglu等[14]最近的研究结果显示乳腺癌的恶性程度与CD44+/CD24-细胞群分化程度直接相关，分化越差恶性程度越高。Balic等[15]对早期乳腺癌患者的骨髓标本进行了研究,通过免疫组织化学、免疫荧光等方法发现这些骨髓标本中存在CK+表达。所有CK+的标本中均有表达CD44+/CD24-的细胞(33％～100％,中位值65％);而原发肿瘤中CD44+/CD24-细胞的比例不超过10％。这项实验证实了在早期乳腺癌骨髓播散分布的肿瘤细胞中多数具有乳腺癌干细胞的表型,与原发病灶存在明显差异，提示早期乳腺癌患者骨髓中可能已经存在转移来的乳腺癌干细胞,从而导致治疗后的转移或复发。

2.2 乳腺癌干细胞与预后

Shipitsin等[16]研究发现,CD44+/CD24-的乳腺癌细胞基因标志是乳腺癌患者预后差的独立因素。Mylona等[17 ]用免疫组化双染的方法对136例浸润性乳腺癌的患者进行了CD44 + /CD24 - 和CD44 - /CD24 +与乳腺癌转移及预后的关系研究,其研究表明CD44 + /CD24 -与淋巴结的转移及肿瘤的分级呈负相关,与患者的生存率呈正相关;而CD44 - /CD24 +与临床病理分级没有关系,与患者的生存率呈负相关。Ginestier等[18]研究发现,ALDH1是乳腺癌干细胞的标志之一,而且是乳腺癌患者预后差的独立因素。Zhou等[19 ]对国际12项已发表的研究成果进行了meta分析，结果显示乳腺癌患者的ALDH1 +(RR=2.83,95％ CI:2.16～3.67,P<0.001)以及 CD44+/CD24-/low(RR = 2.32,95％ CI:1.51～3.60,P<0.001)的肿瘤细胞的含量与患者的OS显著相关。

3 乳腺癌干细胞与治疗

现有的乳腺癌治疗方法以杀死或清除一切肿瘤细胞为目的。但放、化疗对存在于肿瘤中数量较少的干细胞样细胞群疗效非常有限，经过治疗后残存的干细胞样细胞群的增殖足以促使肿瘤复发和转移。Lindeman等[20]研究表明休眠肿瘤干细胞具有化疗抵抗能力。所以研究除手术外的传统治疗方法对干细胞样细胞群的作用，为进一步的研究奠定基础就尤为重要。

3.1 乳腺癌干细胞与化疗

肿瘤干细胞具有细胞周期长、代谢慢的特点,因此对抗有丝分裂药物具有较高的耐受性。Piyush等[21]发现盐霉素杀死乳腺癌干细胞的能力比普通的化疗药物如紫杉醇强100倍。与被紫杉醇处理过的肿瘤干细胞相比，经过盐霉素处理过的肿瘤干细胞被注入到实验鼠体内后，成瘤几率显著降低，且实验鼠肿瘤的生长速度也明显减慢。Huang等[22]发现乳腺癌癌相关成纤维细胞通过SDF-1通路而增加CD44+ CD24-细胞的含量，此通路有望成为化疗药物治疗乳腺癌的新靶点。由于乳腺癌干细胞将化疗药物排除细胞外等多种原因而较其他癌细胞具有更强的化疗药物耐受性，因此，增强肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性是迫切需要解决的问题之一。

3.2 乳腺癌干细胞与放疗

自肿瘤干细胞学说提出以来就有推测其对放疗可能存在耐受性。Phillips等[23]将乳腺癌细胞悬浮培养制备乳腺球和贴壁培养,2种培养来源的细胞均制备成单细胞悬液,经2 Gy剂量放射线照射后,结果显示乳腺球来源的细胞具有更强的抗辐射性,两者经照射后中位存活率相差近20％。同时Phillips等体外研究还表明,MCF-7细胞经放疗后乳腺癌干细胞的比例由3.5％增加到7.5％(P=0.009)。检测与放射敏感性相关分子,如活性氧水平、组蛋白H2AX磷酸化等,乳腺球来源细胞这2种物质均减少。分次照射后,非黏附性CD44+CD24-细胞在单细胞悬液中比例增加,提示这类细胞相对于其他细胞具有更强抗辐射能力。Woodward等[24]将Wnt1转基因小鼠来源的乳腺细胞和β-catenin转染的乳腺细胞经放射线照射后发现SP细胞比例增加较对照组更明显,且射线照射后激活的β-catenin在Lin-CD29hCD24+表型细胞中选择性高表达,提示Wnt1和β-catenin可能调控乳腺干细胞的抗辐射能力。这些实验结果证实了一直以来人们的1种推测,即肿瘤干细胞对放疗具有抵抗性。但是这些研究还只是停留在体外实验上,体内的结果还有待进一步验证。

3.3 乳腺癌干细胞与内分泌治疗

对于雌激素受体阳性的乳腺癌患者,内分泌治疗是十分重要的治疗方法。因此,雌激素及各种抗雌激素药物对激素受体阳性乳腺癌中肿瘤干细胞的影响至关重要,其最终可能决定着乳腺癌内分泌治疗的成败。许健等[25]应用ER阳性的乳腺癌细胞系MCF-7来研究雌二醇(E2)及拮抗剂他莫西芬( tamoxifen,TAM)对其中肿瘤干细胞相关亚群(CD44+CD24-/low细胞)含量的影响,从肿瘤干细胞的角度来探讨乳腺癌内分泌治疗的作用，从而得出不同浓度E2作用下,MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群含量增加,而在相同浓度的E2作用下,添加抗雌激素药物TAM能够使MCF-7中肿瘤干细胞相关亚群含量降低。对于激素受体阳性的乳腺癌患者,内分泌治疗具有很好的疗效。但是,内分泌治疗的作用机制十分复杂,很多尚处于探索阶段。

总之，乳腺癌干细胞理论为根治乳腺癌开辟了新的治疗途径，肿瘤治疗研究开始以特异性乳腺癌干细胞为主要目标，即从源头上根治肿瘤。发现和阐明乳腺癌干细胞的本身的特性，将为抗肿瘤药物的研发提供新的靶点，针对乳腺癌干细胞的新一代特异性强的抗肿瘤生物及免疫药物有望极大地提高肿瘤的治疗效果。但到目前为止,肿瘤干细胞研究刚刚起步,仍存在诸多问题,科研工作者们也面临着更多的挑战。

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