HLA基因分型方法的进展

刘 川综述，宁 安审校

(1、南昌大学第二附属医院；2、江西省寄生虫研究所 330006)

1 概述

人类白细胞抗原(HLA)基因位于第6号染色体短臂6P21.3区，是已知人类基因组中基因最丰富的一个区域，至少包括239个基因座[1]。HLA分型已用于组织配型，器官移植、疾病相关性研究、人类学和法医学等领域。HLA分型过去主要采用血清学和细胞学方法，随着PCR技术，基因芯片技术等分子生物学技术的发展，已建立了从DNA水平上进行分型的HLA基因分型技术。我们对近年来出现的几种HLA基因分型方法作一概述。

2 方法

2.1 PCR-SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)

PCR-SSOP是以核酸杂交为基础的分型技术。其原理是：先对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记，然后针对PCR扩增产物根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在膜上，最后将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果。该方法灵敏度非常高，1个碱基的差异都能被检测出来[2]。

PCR-SSOP技术用于HLA分型主要包括正相SSOP方法和反相 SSOP方法两种。前者是将PCR产物固定在膜上，用标记的探针与之进行杂交，后者是将特异性探针固定在膜上， 用标记的PCR产物与之杂交[3]。目前广泛采用的是反相 SSOP方法。它特别适合于大批量实验，如在脐血库和骨髓库HLA分型中作为首选的方法。与传统方法相比较，PCRSSOP法具有灵敏度高、特异性强、需样品量少等优点。它不象电泳技术那样，在鉴定不同系列凝胶中DNA片段的精确大小时，存在误差等问题，因此可用于其它技术不易分辨的等位基因的检测及位点的鉴定。到目前为止。各国学者设计的探针，可用于检测几乎所有目前所知HLA等位基因。

2.2 PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)

九十年代初随着PCR方法与之结合，该方法得到普遍推广。其原理是：HLA特异等位基因内部存在多个核酸内切酶位点，由于不同的HLA特异等位基因之间存在着核苷酸的差异，用相同的限制性核酸内切酶去消化这些特异性等位基因的差异位点，会得到不同长度、不同数目的DNA片段。经电泳，溴乙锭染色，紫外照射成像后借助HLA分型程序或手工查表即可确定HLA基因型别。邬于川[4]等应用PCR-RFLP方法进行了HLA-DPB1等位基因与四川汉族人哮喘的相关性研究。

PCR-RFLP法准确性好，但选择怎样的核酸内切酶来消化和区分所有等位基因是该技术的关键问题。现可通过计算机软件辅助解决该问题，但是如果等位基因PCR扩增片段中只有1～2个核苷酸差别时，可能找不到能对它们加以区分的特异的限制性核酸内切酶，需做PCR-SSCP补充区分。而且有时由于实验条件等原因,扩增产物有不被内切酶消化切割的可能。PCR-PFLP由于其技术复杂与HLA本身高度多态性，其限制性片段格局表现异常复杂,使其在HLA研究领域内的应用受到一定程度的限制。

2.3 PCR-SSP(序列特异性引物)

根据HLA各型别核苷酸碱基序列差异性，设计出一系列特异性引物。因Taq DNA聚合酶没有3′→5′核酸内切酶活性，引物3′端最后一个碱基是否与模板配对决定着能否扩增出产物。若将引物的3′端最后一个碱基设计在各特异性之间正好有差异的那个碱基序列上，则扩增产物仅需常规琼脂糖电泳，根据特异产物存在与否即可直接对HLA基因进行型。该方法关键是特异引物的设计与PCR体系的准确无误。可通过提高退火温度，加入内源性阳性对照等措施确保产物的特异性和反应体系的特异性。黄飞[5]等进行PCR-SSP/PCR-SBT-HLA高分辨等位基因分型比较，发现两种方法具有实验互补意义。若同时应用两种方法能够有效改善HLA等位基因高分辨分型的准确性和重复一致率。

PCR-SSP与 PCR-SSOP，PCR-RFLP 相比较，具有以下特点：(1)高度特异性：针对各等位基因顺序设计的引物，从PCR第一个循环开始就是特异性扩增，提高退火温度又加强了这种特异性。(2)简便而迅速地结果判断。(3)高度分辨率：每对引物对特定顺序片段进行百万倍以上的扩增,产物分辨率高。但是用PCR-SSP法由于涉及多对引物进行检测，实验成本高，而且由于特异引物的有限性，有些罕见的HLA-DR特异性难以用此方法检出。

2.4 PCR-SNP(单核苷酸多态性)

单核苷酸多态性是人类基因组中存在的以每1000个碱基出现1～10个稳定遗传双等位基因的单碱基对差异，它可能是人类基因表达和蛋白活动中的一个功能性成分。目前已在HLA-I类基因内以400bp一个SNP的密度发现 了大量的SNP，这为高通量主要组织相容性复合物 (MHC)-SNP检测奠定了基础，该技术较其它技术节省时间和费用。随着第3代遗传标记SNP的发展，有望在HLA复合体中寻找到一系列SNP位点，并绘制其高密度SNP图谱，进一步研制MHC-SNP试剂盒以对HLA进行分型。

因此，第13届IHWC提出了制作HLA区域内高密度SNP图，研发HLA-SNP分型试剂盒，使SNP技术成为一种简易有效的HLA分型方法的目标。2.5 SBT(直接测序分型)

SBT原理是：首先用 PCR扩增获得DNA片段，然后采用测序反应获得扩增片段的碱基序列。由于获得了扩增片断的全部碱基序列，故该方法是最可靠也最彻底的基因分型方法，它不仅能进行序列识别和分型，更有助于发现新的基因型，目前只有通过测序才可准确证实新发现的HLA等位基因。已有报道，血清学结果为空白或PCR-SSP和PCR-SSOP未能检出或几种分型结果不一致时，均可通过SBT技术获得准确、可靠的高分辨结果[6]。Hurley[7]等采用PCR-SBT法对美国NMDP 1775名骨髓移植患者和无关供者作HLA等位基因分型，分析HLA-A，HLA-B，HLA-DR抗原匹配情况发现，骨髓移植病人和供者间HLA等位基因的不匹配情况远远超出预想。

SBT之所以优于PCR-SSP和PCR-SSOP，主要在于它能分析包括非多态性位点在内的整个基因组序列。且SBT不但可以对DNA测序，也可对cDNA测序来分析基因的表达。随着DNA测序技术的普及，该方法越来越受到重视。PCR-SBT法无论在分型精确度、工作效率还是自动化程度都明显优于其他几种分型方法，目前已有专门的HLA分型软件与自动上样的固相测序试剂盒，而且测序费用大大降低。因此，PCR-SBT法是科研工作中最理想的HLA分型方法，随着自动核酸测序成本的降低，这一分型技术将被广泛应用[8]。

2.6 基因芯片或DNA微阵列技术

基因芯片技术由美国Affymetrix公司首先开发。短短数年中，芯片技术进展迅速。其原理为反向斑点杂交，即通过点样仪将成千上万个代表不同基因的寡核苷酸探针点样于固相支持物表面，这些探针可与放射性标记物或荧光素标记的样品DNA或cDNA互补核酸序列相结合，通过放射自显影或荧光检测，杂交结果通过计算机软件处理分析后获得杂交信号的强度及分布模式图，从而反映样品中基因表达的情况。

与现有的分型技术比较，基因芯片分型有如下优势：①具有集成化的优点；②操作非常简便：结果判读通过荧光扫描，而不是凝胶电泳，大大简化了操作，缩短了时间；③灵敏度高：芯片通过2级放大，第1级是在PCR扩增模板D NA时，第2级是在读取杂交结果时荧光素的2级放大，大大提高了灵敏度；④效率高：只需要1张芯片，1次PCR，1次杂交就可以对多个样本进行 HLA-A、B、D R、DQ等位点DNA分型；⑤标准化程度高：采用多种、多点、同步杂交法检测靶基因和自动化分析结果，可确保检测特异性和客观性，最大限度减少人为误差；⑥成本较低：由于芯片制作和检测的自动化程度较高，并且固定在芯片上探针量和PCR所用的样本量很小，芯片可以实现单片多人用，由此使检测的成本降低。这些会促使HLA基因芯片分型技术在临床上得到广泛应用[9]。但是，目前基因芯片还存在着仪器设备昂贵，方法有待标准化以及信号检测低等不足，相信这些问题很快就会得到解决，一旦这种高效的分型方法用于临床 必然会 带来巨大的经济效益与社会效益。

3 展望

上面谈及的几种基因水平上HLA分型方法，是近年来国内外研究得较多的。各种HLA基因分型方法各有优势，不能相互替代。例如PCR-SSP操作简单、快速，但要进行高分辨基因分型，就需要设计大量的序列特异性引物，使整个实验变得十分昂贵，而且操作流程延长。PCR-SSOP进行高分辨基因分型时，也会出现价格昂贵，流程复杂的问题 ，故大有被基因芯片所取代的趋势。芯片自动化程度较高，所需探针量和PCR所用样本量很小，芯片可以实现单片多人使用，由此使检测的成本降低。但由于仪器昂贵，在一定程度上制约了其推广和应用。PCRSNP技术简单、快捷、分辨率高，随着其技术的不断改进,有望成为最为普及的HLA分型方法。SBT是一种分辨率最高、最可靠的分型方法，但由于其价格昂贵,限制其普及使用。为此，不同科研与医疗机构实验室应根据各自的条件、要求和目的而选用合适的方法。就临床组织器官移植而言，采用中分辨度DNA分型技术是最佳选择，刘川[10]等应用PCR-SSP方法进行了造血干细胞移植的HLA分型，获得了准确的结果。就科研工作而言，一般采用高分辨率分型方法。随着各学科之间的渗透与交叉，加强HLA基因分型方法的标准化，使分型向最快最准确的方向发展，将有助于推动HLA的相关研究和各领域研究成果的相互借鉴[11]。

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[4]邬于川,刘春华,范冬梅.HLA-DPB1等位基因与四川汉族人哮喘的相关性研究[J].中国临床医学,2007,14(2):162-164.

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[10]刘 川,邹叶青,李 剑.人类白细胞抗原(HLA)基因分型在造血干细胞移植中的应用[J].实验与检验医学,2008,26(6);587-588.

[11]AbbottWG,Tuku itonga CF,Ofanoa M,et al.Low-cost,simultaneous,single-sequence genotyping of the HLA-A,HLA-B and HLA-C loci[J].Tissue Antigens,2006,68(1):28-37.