参苓白术散加味大黄保护肠黏膜屏障功能的实验研究

广 州 市 中 医 院 外 科(510130) 田立新 张惠东 杨泽娟 阎圣玉广州市天河区红十字会医院 吴春琳

本文研究参苓白术散加味大黄保护肠黏膜屏障功能的作用,为临床上在严重创伤、严重感染、大手术后患者应用该方来调理肠功能、保护肠黏膜功能,减少并发症的发生,提高疗效提供前期依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 NIH小鼠,SPF级,45只,雄性,体重：25～30g。提供单位：广东省医学实验动物中心。实验动物质量合格证明编号：0065784。识别方法：采用被毛染色法,使用饱和苦味酸对 NIH小鼠进行编号,在 NIH小鼠体表不同部位的被毛涂染斑点,以示不同号码。以 NIH小鼠皮肤染色和笼具双重编号标记识别。饲养管理：饲养在广东省医学实验动物中心 SPF级动物房,实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2008-0002,2009年年检合格。动物饲养条件：小鼠饲养于大塑料盒内,每盒 15只,饲养温度 ：20℃ ～ 25℃,湿度 ：40% ～70%,采用 12小时昼夜间断照明;自由进食、饮水。饲养室条件始终保持稳定,以保证试验结果的可靠性。对购入小鼠检疫3天,期间每日检查小鼠 1次,未发现不健康的小鼠,全部健康小鼠进行实验。

1.2 实验药品 供试品名称：参苓白术散加味大黄。编号：TC10043。来源：广州市中医院中药房,常温。对照品名称：瑞素;编号：MC10012;批号：80DC436;性状：液体;来源：华瑞制药有限公司;保存条件：2℃～8℃。

1.3 实验用溶媒 纯净水。

1.4 主要实验仪器与试剂 全自动酶标仪,ELX800,由美国 BIO-TEX生产;电子分析天平,BS-3000A,由上海友声衡器有限公司生产;低速冷冻离心机,KDC-2046,由科大创新股份有限公司中佳分公司生产;3℃～7℃医用保存箱,SRM-CD471,由日本三洋生产;-40℃医用保存箱,MDF-U 5411,由日本三洋生产。主要试剂：小鼠Ⅱ型 A2。ELISA试剂盒：购自武汉华美生物工程有限公司,No.CSB-E08321m。小鼠 ELISA试剂盒：购自武汉华美生物工程有限公司,No.CSB-E11329m。

1.5 剂量设计与分组 设计依据：中药药效研究思路与方法;剂量设计与分组：将 45只小鼠按体重随机分为正常对照组、瑞素组和参苓白术散加味大黄组(实验组),每组 15只。

2 实验方法

2.1 供试品和对照品配制方法 参苓白术散加味大黄 ：人参 7g、云苓 6g、白术 6g、莲子肉 4g、山药 4g、扁豆 4g、砂仁 4g、薏苡仁 4g、桔梗 4g、大黄 4g、甘草 3g。将上述配方 100g,放置于圆形烧瓶中,加入 100mL蒸馏水,100℃加热 2小时后,用细纱布过滤,将其滤液在蒸发器中(50℃)定容至 1000m L(相当于 100g生药/L),冷却后装入消毒玻璃瓶中备用。可重复多次制备供试验用。瑞素：无需配制,现用现取。

2.2 给药方法 实验组小鼠每只灌服 0.5m L,瑞素组小鼠每只灌服瑞素溶液 0.5mL;正常对照组小鼠每只灌服生理盐水 0.5mL,每 8小时 1次,共 3次,动物给药后禁食。

2.3 动物取材 于实验的第 24小时以颈椎脱臼法处死小鼠,取全部小肠称重,量长度,并收集小肠灌洗液、匀浆液。收集方法：1)小肠灌洗液收集：小肠测完重量和长度后,用生理盐水吸取浆膜上的血渍,然后用 10%乙酸 35mL灌洗小肠,分别收集小肠灌洗液,离心取上清液并装入截留分子量为 3500的透析袋,在 4℃去离子水中透析 18小时浓缩后冷冻干燥称重,密封保存于 -20℃冰箱中待用。2)小肠匀浆液制备：收集完灌洗液后,将小肠剪为 2mm长短,在 150mL 30%乙酸溶液中电动冰浴匀浆(4000r/min×10min),分离上清液和沉淀,收集上清液,将上清液装入截留分子量为 3500的透析袋,在 4℃去离子水中透析 18小时浓缩后冷冻干燥称重,密封保存于 -40℃冰箱待用,送广州中医药大学进行冷冻干燥。

2.4 检测指标 1)观察：每次灌胃观察小鼠的外观体态(毛、色、形)及二便情况并作相应记录,若有死亡动物应及时进行解剖,并观察内脏各器官形态变化。2)小肠重量、长度测定：动物处死后,立即剖腹切取从屈氏韧带到回盲部(空肠和回肠),以 2把止血钳分别夹住两端切口,测量其重量(g)和长度(cm)。3)小肠灌洗液及小肠壁组织匀浆中 Lp-PLA2含量检测：应用 ELISA试剂盒检测。4)小肠灌洗液及小肠壁组织匀浆中 LZM含量检测：应用ELISA试剂盒检测。

2.5 统计分析 各组小鼠小肠重量、小肠长度、Lp-PLA2、LZM含量的数据均采用 (±s)表示,采用SPSS13.0方差分析进行各组间的差异性统计分析。

3 实验结果

3.1 小鼠日常情况观察结果 给药前后,各组小鼠均未见异常行为,精神良好,毛有光泽,活动自如,二便正常。

3.2 小鼠小肠重量、长度测定 实验组、瑞素组小鼠的小肠重量及长度与正常对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。见表 1。

表1 小鼠小肠重量、长度测定结果(±s)

表1 小鼠小肠重量、长度测定结果(±s)

n 小肠重量(g) 长度(cm)正常对照组 15 1.491±0.14 57.3±3.2参苓白术散加味大黄组 15 1.509±0.20 57.9±4.5瑞素组 15 1.533±0.13 58.3±3.7

3.3 小鼠小肠灌洗液 Lp-PLA2、LZM测定 实验组小鼠的小肠灌洗液 Lp-PLA 2、LZM含量与正常对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01),与瑞素组小鼠比较差异有显著性(P＜0.05)。瑞素组小鼠的小肠灌洗液 Lp-PLA2、LZM含量与正常对照组比较,差异有显著性(P＜0.05)。见表 2。

表2 小鼠小肠灌洗液 Lp-PLA 2、LZM含量测定结果(±s)

表2 小鼠小肠灌洗液 Lp-PLA 2、LZM含量测定结果(±s)

注：与正常对照组比较,△P＜0.05和△△P＜0.01。

n 小肠灌洗液Lp-PLA 2(ng) LZM(ng)正常对照组 15 36.91±6.69 3.82±0.33参苓白术散加味大黄组 15 46.28±7.32△△ 4.73±0.70△△瑞素组 15 45.11±10.91△ 4.83±0.96△△

3.4 小鼠小肠匀浆液 Lp-PLA2、LZM含量测定 实验组小鼠的小肠匀浆液 Lp-PLA2、LZM含量与正常对照组比较,差异无显著性(P＞0.05);瑞素组小鼠的小肠匀浆液 Lp-PLA2、LZM含量与正常对照组比较,差异无显著性(P＞0.05)。见表 3。

表3 小鼠小肠匀浆液 Lp-PLA 2、LZM含量测定结果(±s)

表3 小鼠小肠匀浆液 Lp-PLA 2、LZM含量测定结果(±s)

n 小肠匀浆液Lp-PLA 2(ng) LZM(ng)正常对照组 15 114.13±34.06 13.51±4.75参苓白术散加味大黄组 15 109.94±42.37 13.58±6.58瑞素组 15 130.68±32.68 16.30±6.37

4 结 论

肠黏膜屏障是阻止肠内细菌移位到血液中引发继发感染的重要屏障。因此,肠黏膜屏障功能健全时,人体不会出现继发感染。当严重创伤、腹部大手术后,禁食时间较长,肠黏膜屏障功能受损,容易出现继发感染而影响预后。因此,禁食时间超过 3天的患者临床上都应重视保护肠黏膜屏障功能[1]。

查阅文献 Lp-PLA2、LZM常用来检测肠黏膜屏障功能[2-3]。在本试验条件下,100g生药/L剂量的参苓白术散加味大黄可以提高 NIH小鼠小肠灌洗液 Lp-PLA2、LZM含量,提示参苓白术散加味大黄可能具有促进小肠 Lp-PLA 2、LZM分泌的作用。临床上在严重创伤、严重感染、大手术后患者可应用该方来调理肠功能、保护肠黏膜功能,减少并发症的发生,提高疗效。

[1] 黄建贤.大黄促进小鼠小肠溶菌酶分泌的实验研究[J].中国医师杂志,2005,(10)：1350

[2] 李玉 .大黄对小鼠肠黏膜屏障保护作用的机理探讨[J].四川大学学报(医学版),2005,(2)：210

[3] 胥楠.大黄对小鼠肠道免疫分泌物的影响[J].中国中药杂志,2005,(18)：1441