骨肉瘤中 Bcl-2和 ILK表达的生物学意义研究

辽宁省人民医院(110016) 杜振广 肖明明

中国医科大学 94期 邓 宁

恶性肿瘤细胞的重要生物学特性是其对周围组织的侵袭和破坏,并在远隔器官形成转移灶,这是一个多环节、多步骤的复杂过程,与肿瘤细胞表面黏附分子、细胞外基质中的蛋白水解酶类和肿瘤细胞的增殖状态关系密切。骨肉瘤是好发于青少年的高度恶性肿瘤,其侵袭性强,较早出现肺等器官的转移,且手术切除后较易复发,因此对骨肉瘤侵袭、转移及复发的相关因素进行研究具有重要的理论及临床意义。本研究采用免疫组织化学 S-P法探讨了 Bcl-2和整合素连接激酶(ILK)骨肉瘤、正常骨中表达的生物学意义,为骨肉瘤的预后判定和基因治疗提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料 正常对照组 15例,骨肉瘤标本 30例。骨肉瘤取自 2002～2009年辽宁省范围内 4家医院截肢、肿瘤切除或手术切取活体检查的标本,用液氮保存。术后所有标本经 3位病理学专家确定诊断。全部病例术前均未发现有转移,均未做化疗,术后或确诊后行相同化疗方案。根据刘昌茂分级法：将其分为Ⅰ级 15例,Ⅱ级 10例,Ⅲ级 5例。随访结果：死亡 17例,存活 13例。分成生存组和死亡组。

1.2 主要试剂 鼠抗人单克隆抗体 Bcl-2;鼠抗人单克隆抗体 ILK;两者及免疫组化 S-P试剂盒均为Zymed公司产品。

1.3 方法 标本均经 10%中性甲醛缓冲液固定。不含钙固定 6～8小时,含钙固定 24～48小时。固定后,含钙经 10%EDTA中性溶液脱钙 3～5周。然后,常规脱水、透明、石蜡包埋,5μm连续切片。按S-P免疫组织化学染色检测试剂盒所附操作程序进行。所有切片染色按相同条件进行染色。

1.4 结果判定

1.4.1 ILK染色结果判定 以胞浆呈棕黄色为阳性,至少观察 5个具代表性的高倍视野(10×40)计数500个瘤细胞中阳性细胞数,按阳性细胞所占的比例分为 5级：阴性;＜25%为Ⅰ级,25%～50%为Ⅱ级,＞50%～75%为Ⅲ级,＞75%为Ⅳ级。

1.4.2 Bcl-2染色结果判定 参照王东等的判断标准稍加改进。阳性反应为黄到棕黄色颗粒。定位于胞浆,亦可见于胞膜。计数 10个高倍视野(10×40),阳性细胞数 ＜5%为阴性,5%～25%为 1分,＞25%～50%为 2分,＞50%～75%为 3分,75%以上为 4分。按阳性反应强度,淡黄色计 1分,黄色计 2分,棕黄色计 3分;两者相乘,1～4分为弱阳性(+),5～8分为中等阳性(⧺),9～12分为强阳性(⧺)。

1.5 统计学处理 Bcl-2阳性率的差异比较用四格表确切概率法。Bcl-2和 ILK指标染色强度比较用成组设计两样本比较的秩和检验(Wilcoxon法),Bcl-2和 ILK相关性采用 X2检验,取 P＜0.05作为差异有显著性的检验标准。

2 结 果

2.1 Bcl-2、ILK染色 Bcl-2为细胞浆着色,呈棕黄色均匀颗粒状。部分细胞有胞膜着色。ILK阳性细胞为细胞核呈棕黄色。

2.2 Bcl-2表达情况 骨肉瘤组与正常骨组染色阳性率和染色强度相比,差异均有显著性(P＜0.05)。骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ级组与Ⅰ级组,死亡组与生存组染色阳性率和染色强度相比,虽有下降趋势,但差异均无显著性(P＞0.05),见表 1。

表1 Bcl-2表达情况

2.3 ILK表达情况 骨肉瘤组与正常骨组,骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ级组与Ⅰ级组,死亡组与生存组相比,ILK差异有显著性(P＜0.05),见表 2。

表2 ILK表达情况(例)

2.4 Bcl-2和 ILK的相互关系 通过 2×2列联表进行分析,发现 Bcl-2和 ILK表达一致性占 76.7%,两者表达具显著相关性(P＜0.05),见表 3。

表3 Bcl-2与 ILK的关系

3 讨 论

Bcl-2为拮抗细胞凋亡的基因,其产物并不加速细胞分裂、增殖而是促进细胞生存,作为“生存基因”保持正常或癌变细胞免受各种诱导剂诱发的细胞凋亡。有学者证实,Bcl-2能抑制骨肉瘤细胞系的凋亡[1-2]。本研究发现骨肉瘤组比正常骨组 Bcl-2蛋白染色阳性率和染色强度均增高,提示骨肉瘤发生与拮抗凋亡基因 Bcl-2表达增高有关。Bcl-2基因表达与肿瘤生物学行为的关系目前颇有争议[3]。Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡,理论上该基因表达越高,肿瘤恶性程度应越高,预后应越差。某些肿瘤如胃癌、结肠异时性腺瘤等与此相符。某些肿瘤如胰腺癌等研究结果却与之相反。某些肿瘤如滑膜肉瘤等发现 Bcl-2蛋白表达和预后无关。

本研究结果发现,随着骨肉瘤分级的增加,随着生存时间的减少,Bcl-2蛋白染色阳性率和染色强度均有下降趋势,但无统计学意义,提示 Bcl-2蛋白染色阳性率和染色强度不能作为判断骨肉瘤分级和预后的指标。由于本研究样本数量较小,骨肉瘤中Bcl-2蛋白表达的生物学意义尚需扩大样本进一步研究。

ILK是新近发现的一个具有 3个结构单位的Ser/Thr蛋白激酶,作为整合素和生长因子受体信号传导途径中的一个重要效应物,ILK调节着细胞的粘着、生存、分化和凋亡[2]。其相关蛋白 PKB、GSK3等是细胞程序死亡和细胞周期循环的重要调节蛋白[4-6]。由于这些原因,使得 ILK与肿瘤的形成、浸润转移和临床预后等密切相关。ILK在许多肿瘤中都存在过量表达,ILK的过量表达或组成性活化与肿瘤的形成和侵袭转移密切相关[7-12]。本研究结果发现,ILK在骨肉瘤组与正常骨组,骨肉瘤Ⅱ、Ⅲ级组与Ⅰ级组,死亡组与生存组相比,ILK差异有显著性,提示 ILK在骨肉瘤的发生、发展中起重要作用,可通过调节细胞外基质的的合成与降解代谢而影响细胞之间,细胞与基质之间的信息传递,调节细胞分化及迁移,进而可能影响肿瘤的生物学行为。

[1] Lin D,Feng J,Chen W.Bc l-2 and caspase-8 related anoikis resistance in human osteosarcoma MG-63 cells[J].Cell Biol Int,2008,32(10)：1199

[2] Kaseta MK,Khaldi L,Gomatos IP,et al.Prognostic value of bax,bc l-2,and p53 staining in primary osteosarcoma[J].J Surg Oncol.2008,1;97(3)：259

[3] Córdoba A,Guerrero D,Larrinaga B,et al.Bcl-2 and CD 10 expression in the differential diagnosis of trichoblastoma,basal cell carcinoma,and basal cell carcinoma with follicular differentiation[J].Int JDermatol,2009,48(7)：713

[4] Lal H,Verma SK,Foster DM,et al.Integrins and proximal signaling mechanisms in cardiovascular disease[J].Front Biosci.2009,1;14：2307

[5] Honda S,Shirotani-Ikejima H,Tadokoro S,et al.Integrin-linked kinase associated with integrin activation[J].Blood,2009,21;113(21)：5304

[6] Kim YB,Choi S,Choi MC,etal.Cell adhesion-dependent cofilin serine 3 phosphorylation by the integrin-linked kinase.c-Src complex[J].JBiol Chem,2008,11;283(15)：10089

[7] Kim YB,Lee SY,Ye SK,et al.Epigenetic regulation of integrinlinked kinase expression depending on adhesion of gastric carcinoma cells[J].Am JPhysiol Cell Physiol.2007,292(2)：857

[8] Fuchs BC,Fujii T,Dorfman JD,etal.Epithelial-to-mesenchymal transition and integrin-linked kinasemediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells[J].Cancer Res.2008,1;68(7)：2391

[9] RosanòL,Spinella F,Di Castro V,et al.Integrin-linked kinase functions as a downstream mediator of endothelin-1 to promote invasive behavior in ovarian carcinoma[J].Mol Cancer Ther,2006,5(4)：833

[10] Edwards LA,Woo J,Huxham LA,et al.Suppression of VEGF secretion and changes in glioblastomamultiformemicroenvironment by inhibition of integrin-linked kinase(ILK)[J].Mol Cancer T-her,2008,7(1)：59

[11] Wong RP,Ng P,Dedhar S,et al.The role of integrin-linked kinase in melanoma cellmigration,invasion,and tumor growth[J].Mol Cancer Ther.2007,6(6)：1692

[12] Okamura M,Yamaji S,Nagashima Y,et al.Prognostic value of integrin beta1-ILK-pAkt signaling pathway in non-small cell lung cancer[J].Hum Pathol,2007,38(7)：1081