发酵产1，3-丙二醇的关键酶研究进展

张宏蕊，金 平，刘树臣

(1.辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁 抚顺 113001；2.中国石化抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺 113001)

1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PDO)是一种重要的化工原料，可直接用作防冻剂，也是增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料，广泛用于食品、化妆品和制药等行业。1，3-丙二醇目前最主要的消费领域是用作新型聚酯——聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的主要原料[1]。PTT具有良好的染色性、生物可降解性、抗污性，且具有和尼龙相当的韧性、回弹性及抗紫外线性能，其研发生产引起了世界合成纤维行业的重视。我国是聚酯生产大国，但大宗工业用1，3-丙二醇仍需进口，开发1，3-丙二醇是发展新型纤维的关键。因此，我国将1，3-丙二醇的生物发酵生产技术开发列为“十五”、“十一五”科技攻关项目[2]。

近年来，国内外对产1，3-丙二醇的不同微生物进行了详尽研究，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乳酸菌属(Lactobacillusbrevis)、弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)等，这些产1，3-丙二醇的天然菌株中含有的1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)都是以NAD为辅酶，其相关基因的克隆和表达已有较多报道[3～6]。发酵生产1，3-丙二醇的过程中，各代谢途径中酶的作用举足轻重。作者在此就近年来国内外对发酵产1，3-丙二醇的关键酶的研究进行了综述。

1 1，3-丙二醇氧化还原酶

肺炎克雷伯氏菌发酵生产1，3-丙二醇的过程是以甘油为底物，在甘油脱水酶(GDHt)的作用下转化为中间产物3-羟基丙醛；3-羟基丙醛在1，3-丙二醇氧化还原酶的催化下生成1，3-丙二醇。甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶是该代谢途径中的关键酶，其相关编码基因dhaB及dhaT已在大肠杆菌(Escherichiacoli)中获得成功表达，但dhaT的异源表达活性明显低于dhaB[7]，容易导致中间产物3-羟基丙醛的积累，3-羟基丙醛会抑制1，3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的活性，进而影响菌体的生长和甘油的代谢[8]，在天然产1，3-丙二醇菌株Klebsiellapneumoniae体内也存在类似问题。克雷伯氏菌属兼性厌氧菌，并且其生理生化特性与大肠杆菌非常相近，这就为基因工程改良菌种和构建基因工程菌奠定了生理基础[9]。因此，美国DuPont公司构建了产1，3-丙二醇的重组菌株，研究发现，未转入dhaT基因的重组Escherichiacoli也能产生一定量1，3-丙二醇。表明在Escherichiacoli中必定存在一种非异性的能催化3-羟基丙醛还原反应的醇脱氢酶，在进一步的研究中，将大肠杆菌自身的yqhD基因强化表达后，催化3-羟基丙醛的还原反应得到显著加强，1，3-丙二醇最终产量达到135 g·L-1[10]。这是由于yqhD基因编码的1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶在微生物体内可代替dhaT基因编码的1，3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛生成1，3-丙二醇，并且催化活性远高于1，3-丙二醇氧化还原酶，同时该酶还能作用于多种含醛基团的底物[11]。

朱建国等[12]以大肠杆菌(Escherichiacoli)基因组为模板，PCR扩增出1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD，经测序确认，将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR，重组质粒转KlebsiellapneumoniaeME308；经37℃、1.0 mmol·L-1IPTG诱导8 h，重组菌中1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16 U·mg-1，而对照菌株的酶活力仅为0.62 U·mg-1；将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养，经IPTG诱导，可将60 g·L-1甘油转化为33.8 g·L-11，3-丙二醇。

在诸多产1，3-丙二醇的微生物中，肺炎克雷伯氏菌和梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌的产率较高。杨登峰等[13]以丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到1，3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT。将它连接到pMD 18-T载体上，得到重组质粒pMD-dhaT，对此重组质粒进行序列测定，其DNA序列分析结果表明，dhaT基因全长为1158 bp。将dhaT基因插入表达载体pSE-380中，构建成重组子pSE-dhaT，并在大肠杆菌JM109中进行诱导表达。研究表明，以1，3-丙二醇为底物时，基因工程菌经37℃、1.0 mmol·L-1IPTG诱导14 h，酶活力达到16.28 U·mL-1，比原始菌株提高5～6倍。

2 甘油脱水酶

2.1 甘油脱水酶

生物法合成1，3-丙二醇通常都是以甘油作底物，经甘油脱水酶(编码基因dhaB)及1，3-丙二醇氧化还原酶(编码基因dhaT)催化完成。甘油脱水酶在催化甘油转化为3-羟基丙醛的同时，会出现甘油导致的自杀性失活现象。失活的主要原因是甘油导致辅酶B12的C-Co键发生不可逆断裂，形成5-脱氧腺苷和烷基钴氨素类似物(即被修饰的辅酶)，同时烷基钴氨素与脱水酶紧密结合，致使甘油脱水酶发生不可逆性失活[14]。因此，如何使失活的甘油脱水酶复活并提高其催化效率十分重要。

Toraya等将产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)中二醇脱水酶编码基因与其两侧的两段读码框编码的基因在大肠杆菌(Escherichiacoli)中共同表达后，其感受态细胞能使失活的甘油脱水酶恢复其催化活性，也能激活甘油脱水酶-氰钴氨素的复合体。因此，认为这两段读码框可能编码二醇脱水酶复活蛋白(简称激活因子)，分别命名为ddrA和ddrB基因；后来的研究者发现并证实了存在于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的甘油脱水酶激活因子和来源于弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)的激活因子。

来源于不同菌种的激活因子及其编码基因略有差异，但交叉活化(Cross activatation)研究表明，来源于弗氏柠檬菌的激活因子dhaF-dhaG复合体，还可以有效地激活肺炎克雷伯氏菌中失活的甘油脱水酶及脱水酶—氰钴氨素的复合体[15]。杜邦公司克隆出orfXor7并与甘油脱水酶编码基因dhaB及1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶编码基因yqhD串联表达，所构建重组菌的1，3-丙二醇产量明显提高。张晓梅等[16]利用PCR技术扩增来源于弗氏柠檬菌(Citrobacterfreundii)的甘油脱水酶编码基因dhaB以及甘油脱水酶激活因子编码基因dhaG-dhaF，将其与1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶编码基因yqhD串联在温控表达载体pHsh上，构建重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。SDS-PAGE分析显示，融合表达产物的分子量同核酸序列测定的推导值相符。与未串联甘油脱水酶激活因子编码基因的重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)相比，1，3-丙二醇的产量提高了28%。

2.2 二醇脱水酶

Klebsiellaoxytoca的二醇脱水酶由3个亚基组成，形成一种六聚体结构azB2，需要在辅酶B的辅助下才能有效地进行催化，属于第Ⅱ类以B12(Adenosylcobalamin，腺苷钴氨素，AdoCb1)作辅酶的生物催化剂[17～19]。二醇脱水酶的作用主要是与辅酶B12有机结合后产生电子受体，从而将甘油或1，2-丙二醇转化为相应的醛。二醇脱水酶很容易失活，底物甘油、氧以及辅酶类似物都是可能的诱导因素[20，21]。

Raynaud等研究发现，在以甘油为碳源、不含维生素B12的培养基上培养携带有ClostridiumbutyricumVPI 1718的1，3-丙二醇操纵子的E.coli时，能产生1，3-丙二醇并且检测到很高的甘油脱水酶活性[3，22，23]，其结构与K.oxytoca中依赖辅酶B12的二醇脱水酶没有同源性。

郑学瑞[24]从ClostridiumbutyricumDSM 10702基因组中扩增到含甘油脱水酶(一种二醇脱水酶的同功酶，但不依赖于辅酶B12)基因的1，3-丙二醇操纵子，利用表达载体plTK将其转入1，3-丙二醇生产菌K.oxytocaDA-1HB中，获得了重组菌K.oxytocaPK，并研究了其生长代谢性能。结果表明，重组质粒稳定性良好，厌氧摇瓶培养时的1，3-丙二醇产量提高了52.7%。

3 GDHt和PDOR的共表达

甘油脱水酶(GDHt)和1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是甘油歧化为1，3-丙二醇的两个关键酶。

曲荟锦等[25]采用多顺反子重组和质粒共存两种策略，对来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的两个关键酶进行共表达。构建表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT，将两酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔，在E.coliBL21(DE3)高水平共表达了GDHt 3个亚基和PDOR，表达蛋白分别约占菌体总蛋白的18%、9%、7%和9%。质粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共转化得到E.coliBL21(DE3)稳定的双质粒系统，48 h后84%的细胞能同时含有两种质粒，GDHt 3个亚基和PDOR分别约占菌体总蛋白的16%、8%、6%和11%。

Zeng等[26]对Klebsiellapneumoniae的代谢工程改造进行了大量研究，构建了含有编码甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶基因的质粒，并将其插入野生菌种中，结果表明这两个酶的活性得到了大幅提高。但是在实际的发酵过程中，该工程菌并未产出高浓度的1，3-丙二醇。这是因为在Klebsiellapneumoniae1，3-丙二醇合成途径中，过于加强甘油脱水酶基因表达，导致NADH供应不足而使3-羟基丙醛累积，对菌体生长及1，3-丙二醇合成造成负面影响。

研究发现，来自大肠杆菌的非特异性氧化还原酶是1，3-丙二醇氧化还原酶的同功酶(编码基因yqhD，以NADPH为辅酶)，它在微生物体内可代替1，3-丙二醇氧化还原酶(以NADH为辅酶)催化3-羟基丙醛生成1，3-丙二醇，是微生物转化甘油生成1，3-丙二醇的另一重要用酶[27，28]。

诸葛斌等[29]为优化Klebsiellapneumoniae1，3-丙二醇的合成途径，利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichiacoli)中扩增出以NADPH为辅酶的1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶编码基因yqhD，从克雷伯氏菌中扩增出2.66 kb的甘油脱水酶基因(dhaB)，构建了产1，3-丙二醇关键酶基因的串联载体pEtac-dhaB-tac-yqhD，并将其转入到野生肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中，重组载体得到了表达。通过初步发酵，重组后克雷伯氏菌1，3-丙二醇的产量比原始菌提高20%左右，副产物乙酸和丁二醇产量分别下降30%左右。

4 展望

与化学合成法相比，微生物法产1，3-丙二醇具有选择性好、转化率高、产物分离较简单、无环境污染、可利用再生资源等优点，符合当今社会可持续发展和科学发展的要求。微生物法将逐渐取代化学法用于1，3-丙二醇的生产。

未来研究中，可从微生物中提取纯化酶并将其商品化；可将酶固定化循环使用，节约成本；可制备模拟酶。模拟酶是根据酶的作用原理，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学方法制成高效、高选择性、比天然酶结构简单、具有催化活性且稳定性较高的非蛋白质分子的一类新型催化剂。最重要的是，在以后的研究中，必然还会发现与1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶等具有相同作用的酶，从而有更多菌种可以选择，以便1，3-丙二醇的生产更普遍、更广泛。

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