实时荧光定量PCR检测WISP-1/NGX6基因体系与子宫颈癌细胞增殖转移的关系

秦杰，陈瑾，黄守国

·生物诊断技术·

实时荧光定量PCR检测WISP-1/NGX6基因体系与子宫颈癌细胞增殖转移的关系

秦杰，陈瑾，黄守国

目的探讨原癌基因 WISP-1 和抑癌基因 NGX6 与子宫颈癌细胞增殖转移的关系。

宫颈肿瘤； 原癌基因； 基因表达

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2011, 6(6):410-414

子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，是女性患者的主要死亡原因之一。近年来子宫颈癌的防治已取得较大的进展，子宫颈癌的发病率亦明显下降，但年轻妇女子宫颈癌的发病率则呈明显上升趋势，并由此引起国内外学者的广泛关注，而寻找子宫颈癌早期诊断的基因指标及有效治疗子宫颈癌的方法，进一步明确子宫颈癌发生、发展的分子生物学以及基因表达机制也已成为当前的研究热点。虽然目前已有常规实验方法如免疫组化等从组织学角度对子宫颈癌在蛋白质分子水平进行了分析研究，但有关基因水平的研究报道甚少，尤其是原癌基因 WISP-1/抑癌基因 NGX6 体系在子宫颈癌组织中的表达，国内外至今尚未见报道。

鉴于此，为了研究 WISP-1/NGX6 基因体系与子宫颈癌细胞增殖转移的关系，了解其在子宫颈癌的发生、发展过程中的表达规律，本研究利用实时荧光定量 PCR技术对子宫颈癌转移组、未转移组及正常子宫颈组织标本中该基因体系的表达情况进行了检测，并对比分析了 3 组标本中该基因体系的表达量，以期为进一步有效预防和治疗子宫颈癌提供有利依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本来源 90 例标本均取自中南大学湘雅医学院附属海口医院妇科手术切除标本，患者年龄 25 ～ 65（47.38 ± 12.35）岁。入选标本均以病理诊断为标准，其中正常子宫颈组织标本（病理诊断为慢性宫颈炎或非癌变组织）30 例，子宫颈浸润癌（子宫颈鳞状细胞癌）60 例，而子宫颈浸润癌又分为转移组和未转移组各 30 例。所有病例术前均未经化疗、放疗、生物治疗等其他治疗，并排除其他系统合并症及其他系统肿瘤等疾病。标本离体后立即取材，–80 ℃ 冰箱保存。

1.1.2仪器与试剂 MJ Opticon2 荧光定量 PCR仪为美国 BIO-RAD 公司产品；Taq 酶（货号DR001A）购自日本 TaKaRa 公司；Rever Tra Ace-α-反转录试剂盒（FSK-100）购自日本 Toyobo 公司；其余常规化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1引物与探针的设计与合成 参考人WISP-1、NGX6 基因 mRNA 序列（GenBank：NM-080838、NM-001042590），利用 Primer express2.0 软件分别设计针对WISP-1、NGX6 及内参照β-肌动蛋白（β-actin）的引物（P1 ～ P6）与探针，并分别在探针的 5′ 端引入 FAM 羧基荧光素，3′ 端引入荧光淬灭基团，其序列见表 1。引物和探针均由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2人子宫颈（癌）组织总 RNA 的提取 自超低温冰箱中取出人子宫颈（癌）组织标本，迅速用剪刀剪下约 0.25 g 样品，置于预先加入 200 µl RNAiso™ Plus 的 1.5 ml EP 管中。在 RNAiso™Plus 溶液中破碎人子宫颈（癌）组织，补充 800 µl RNAiso™ Plus 后混匀。冰上静置 5 min，再加入200 µl 氯仿，旋紧后剧烈振荡 15 s（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化后，在冰上静置 5 min。4 ℃、13800 ×g高速离心 15 min 后，将上层水相移至新管中，然后加入等体积的异丙醇，冰上放置 10 min，4 ℃、13800 ×g离心 10 min。弃上清，以 1 ml 75％ 乙醇[焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制]洗涤沉淀，反复颠倒数次，4 ℃、13800 ×g离心 5 min。弃上清，空气干燥 RNA 10 min，加入 20 μl DEPC 水溶解，立即取 2 μl RNA 溶液进行反转录，剩余 18 μl RNA 溶液 –80 ℃ 冻存。

1.2.3反转录反应 RNA热变性：反应体系总体积为 12 μl，其中包括 25 pmol/µl 随机引物1 μl、DEPC 水 9 μl、RNA 2 μl；65 ℃ 水浴5 min 后迅速在冰上冷却 2 min，离心收集反应液。配制总体积为 20 μl 的反应体系，其中包括第一步变性后的 RNA 溶液 12 μl、5 × RT Buffer 4 μl、dNTP 混合物（各 10 mmol/L）2 μl，RNase抑制剂（10 U/μl）1 μl，Rever Tra Ace 1 μl；RT反应条件为：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.2.4RT-PCR 反应 配制总体积为 25 μl 的反应体系，其中包括 10 × PCR Buffer 2.5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl、dH2O 16 μl、15 pmol/μl 引物 2 μl、15 pmol/μl 探针 0.3 μl、5 U/μlTaq酶0.2 μl、反转录反应产物 cDNA 2 μl。PCR Buffer成分：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）、500 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl2。加样至 96孔定量 PCR 反应孔中，每个样品同时设 3 孔，用于检测同一个指标基因的样本统一上机。在 MJ Opticon2 荧光定量PCR 仪上扩增，反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃5 s，55 ℃ 30 s，共 40 个循环，读取 FAM 荧光数值；30 ℃ 5 s。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 19.0 统计学软件进行数据的统计分析。计量资料基因表达量均采取随机独立样本的t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WISP-1 基因表达量的比较

采用实时荧光定量 PCR方法分别检测子宫颈癌组织转移组与未转移组、正常子宫颈组织中WISP-1 基因的表达量，结果表明原癌基因WISP-1在子宫颈癌组织未转移组中表达量明显高于正常子宫颈组织（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宫颈癌组织转移组中表达量明显高于未转移组（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宫颈癌组织转移组中表达量明显高于正常子宫颈组织（F= 44.770，t= –5.638，P= 0.000、P＜ 0.001）（表 2）。

表1 实时荧光定量 PCR引物与探针序列Table 1 Sequences of primers and probes for real-time fluorescence quantitative PCR

表2 WISP-1 基因在子宫颈（癌）组织中的表达Table 2 The expression of WISP-1 gene in thecervical (cancer) tissues

2.2 NGX6 基因表达量的比较

采用实时荧光定量 PCR方法分别检测子宫颈癌组织转移组与未转移组、正常子宫颈组织中NGX6 基因的表达量，结果表明抑癌基因NGX6在子宫颈癌组织未转移组中表达量明显低于正常子宫颈组织（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宫颈癌组织转移组中表达量明显低于未转移组（P= 0.001、P＜ 0.05）；在子宫颈癌组织转移组中表达量明显低于正常子宫颈组织（F= 20.760，t= 6.024，P= 0.000、P＜ 0.001）（表 3）。

表3 NGX6 基因在子宫颈（癌）组织中的表达Table 3 The expression of NGX6 gene in the cervical (cancer) tissues

3 讨论

肿瘤的恶变过程包括细胞增殖、DNA 过度复制、细胞周期功能紊乱、细胞永生化、逃逸凋亡、血管增生及转移浸润等一系列过程，相应的分子机制主要有原癌基因的激活、抑制癌基因失活等[1]。原癌基因是指一大类可促进细胞分裂并有潜在致癌或促癌作用的基因群；抑癌基因或抗癌基因则是一大类可抑制细胞生长并有潜在抑制癌变作用的基因群。原癌基因的激活与抑癌基因的失活，使细胞生长与分化的调节失控，导致细胞持续分裂和癌变。当抑癌基因失活后，可能使原癌基因充分发挥它的作用而导致肿瘤的发生和发展，但某一种原癌基因与抑癌基因对细胞分裂的正负调控作用，仅仅局限在某一种特定细胞的范畴内有效[2]。正是基于这一认识，目前关于肿瘤细胞增殖的研究正迅速开展，以期在基因水平揭示肿瘤增殖转移的本质，为改进肿瘤的诊断方法和治疗手段提供依据。因此，本研究选用实时荧光定量PCR技术对子宫颈癌及正常子宫颈组织标本中WISP-1/NGX6 基因体系的表达量进行了对比分析，以探讨WISP-1/NGX6 基因体系对子宫颈癌细胞增殖转移的影响。

WISP-1 基因是在对大鼠高转移性和低转移性黑色素细胞突变体进行 RNA 差异筛选时被发现存在于低转移性黑色素细胞中[3]。同时研究发现，WISP-1 基因定位于人染色体 8q24.1 ～ 8q24.3[4]，其转录的原始 mRNA 有 5 个外显子，经剪切加工成2 种转录变异体，是一种富含半胱氨酸且长度为367 个氨基酸的分泌性蛋白多肽。采用 PCR 测定人多种组织样本中WISP-1 基因的表达，发现其存在于多种组织器官，如成人心脏、肾脏、肺、胰腺、胎盘、卵巢、小肠、脾，而在脑、肝脏、骨骼肌、结肠、外周血白细胞、前列腺、睾丸和胸腺中，WISP-1 基因低表达或不表达[5]。WISP-1 基因的生物学功能包括促进细胞增殖、介导细胞黏附、促进细胞外基质增长、刺激细胞转移等生物学功能，同时也可调节较复杂的生物学过程，参与血管形成和肿瘤形成[6]。WISP-1 是 Wnt-1-β-连环蛋白信号通路的下游靶基因，β-连环蛋白是 Wnt 信号通路的关键成分，可以与 Wnt 信号通路中的其他成分相结合，它在细胞质和细胞核中的水平改变还可影响某些基因的表达；在细胞质中突变的 β-连环蛋白将与 DNA 结合因子相互作用，进而激活下游基因，引起一系列的改变，促进肿瘤形成；而WISP-1 作为该通路的下游靶基因，自然与肿瘤的形成紧密相关[7-10]。

本研究发现，子宫颈癌组织转移组与未转移组中WISP-1 基因的表达量均高于正常子宫颈组织，且子宫颈癌组织转移组中该基因的表达量明显高于未转移组，由此说明WISP-1 基因与子宫颈癌细胞的增殖及转移成正相关，即该基因可促进子宫颈癌的形成，对癌细胞转移亦有促进作用，但具体作用机制还有待进一步研究。

NGX6 基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位候选克隆策略克隆而成的一个鼻咽癌候选抑瘤基因（基因登陆号：AFl88239），其定位于染色体 9P21 ～ 22 区。而 9P21 ～ 22 区域的等位基因杂合性丢失现象是人类多种肿瘤组织中的共同事件，这提示NGX6 基因可能为肿瘤相关基因[11]。生物信息学分析表明该基因 cDNA 全长2.1 kb，编码 1 个含 338 个氨基酸的跨膜蛋白，其具有 2 个跨膜结构（234 ～ 256、269 ～ 291），胞外区含有 1 个 EGF-like domain（185 ～ 221）、3 个N-糖基化位点（92 ～ 95、100 ～ 103、172 ～ 175）；胞内区较短，含有 1 个酪氨酸激酶磷酸化位点（257 ～ 268），提示 NGX6 基因可能编码 1 种跨膜蛋白，并通过其酪氨酸激酶磷酸化位点、N-糖基化位点等功能域调控细胞的增殖、黏附和运动等生物学过程[12]。同时，有研究已经证实 NGX6 基因在结肠癌，尤其在伴有远处转移的结肠癌组织中表达明显下降甚至缺失[13]。另外，有实验已初步证实NGX6 基因可对 Wnt-1-β-连环蛋白信号通路进行负调控，并推测 β-连环蛋白可能即为 NGX6 的作用靶点[14]。

本研究发现，NGX6 基因在子宫颈癌组织转移组及未转移组中表达量均低于正常子宫颈组织，且子宫颈癌组织转移组中该基因表达量明显低于未转移组，由此说明 NGX6 基因表达量的降低与子宫颈癌的发生相关，亦与子宫颈癌的转移相关。

综上，本研究结果表明，原癌基因 WISP-1 在子宫颈癌组织转移组及未转移组中的表达量均明显高于正常子宫颈组织，在子宫颈癌组织转移组中的表达量明显高于未转移组；抑癌基因 NGX6 在子宫颈癌组织转移组及未转移组中表达量均低于正常子宫颈组织，在子宫颈癌组织转移组中的表达量明显低于未转移组，即提示 WISP-1/NGX6 基因体系表达异常与子宫颈癌的发生有关，并且其作用均与 Wnt 信号通路有关。但本实验标本局限于新鲜组织，要求术后 30 min 内立即取材保存，子宫颈癌患者取材对病理报告结果具有一定不良影响，因此实验标本数量偏少。此外，本实验仅对 WISP-1 和 NGX6 基因的表达情况进行了检测及详细分析，而对于其基因功能未进行具体研究，因此关于WISP-1/NGX6 基因体系可否作为子宫颈癌早期诊断与监测的基因指标，其是否参与子宫颈癌的发生、发展等问题尚有待进一步实验研究。

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Correlation betw een WISP-1/NGX6 gene expr ession and cervical cancer cell pr oliferation and/or metastasis analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR

QIN Jie, CHEN Jin, HUANG Shou-guo

ObjectiveTo explore the correlation between oncogene WISP-1 and tumor-suppressor gene NGX6 expression and cervical cancer cell proliferation and/or metastasis.MethodsPrimers and probes were designed and synthesizes based on the mRNA sequence of human WISP-1 and NGX6 gene, respectively. Total RNA were extracted from human normal cervixtissues (30 cases) as well as non-metastasis and metastasis group (30 cases for each group) of cervix invasive cancer (cervical squamous cell carcinoma) tissues, and the expressions of WISP-1 and NGX6 gene were detected and compared by real-time quantitative fluorescence PCR.ResultsThe expression of the oncogene WISP-1 in both metastasis and non-metastasis group of cervical cancer tissues were significantly higher than normal cervical tissues (with P ＜ 0.001 for both). Moreover, WISP-1 gene expression in the metastasis group was significantly higher when compared to the non-metastasis group of cervical cancer tissues (P ＜ 0.001). The expression of tumor-suppressor gene NGX6 in both metastasis group and non-metastasis group of cervical cancer tissues were lower than normal cervical tissues (with P ＜ 0.001 for both). Similarly, NGX6 gene expression in the metastasis group was significantly lower when compared to the non-metastasis group of cervical cancer tissues (P ＜ 0.05).ConclusionWISP-1/NGX6 gene expression has correlation with cervical cancer cells proliferation and metastasis.

Uterina cervical neoplasms; Proto-oncogenes; Gene expression

HUANG Shou-guo, Email: shouguohuang@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.003

海南省自然科学基金（2011-SZR-01-093）

570208 海口，中南大学湘雅医学院附属海口医院妇产科

黄守国，Email：shouguohuang@126.com

2011-10-14

方法参考人 WISP-1、NGX6 基因 mRNA 序列分别设计引物与探针。提取人正常子宫颈组织（30 例）、子宫颈浸润癌（均为子宫颈鳞状细胞癌）组织未转移组及转移组（各30 例）总 RNA，采用实时荧光定量 PCR 技术分别检测各组标本组织中 WISP-1、NGX6 基因的表达量并进行对比分析。

结果原癌基因 WISP-1 在子宫颈癌组织转移组及未转移组中的表达量均明显高于正常子宫颈组织（均 P ＜ 0.001），在子宫颈癌组织转移组中的表达量明显高于未转移组（P ＜0.001）。抑癌基因 NGX6 在子宫颈癌组织转移组及未转移组中的表达量均低于正常子宫颈组织（均 P ＜ 0.001），在子宫颈癌组织转移组中的表达量明显低于未转移组（P ＜0.05）。

结论WISP-1/NGX6 基因体系与子宫颈癌的细胞增殖有关，并且与子宫颈癌细胞的转移亦有相关性。

Author Affiliation:Department of Gynecology and Obstetrics, Affiliated Haikou Hospital, Xiangya Medical College of Central South University, Haikou 570208, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):410-414