HIV-1 gp41蛋白的表达及其免疫反应性

梁权，罗春贞，毛培菊，王缦

·生物诊断技术·

HIV-1 gp41蛋白的表达及其免疫反应性

梁权，罗春贞，毛培菊，王缦

目的高效表达 HIV-1 gp41 基因片段，满足生产 HIV 体外检测试剂的需要。

HIV-1； 蛋白质类； 免疫活性

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2011, 6(6):415-419

HIV 在我国的流行形势日趋严峻，全国首次HIV 分子流行病学调查发现有 A、B（欧美 B）、B′（泰国 B）、C、D、E 和 F 7 种亚型，其中 B（占 47％）、C（占 34％）是主要流行亚型。第 2 次全国 HIV 流行病学调查显示有 A、B、B′、C、D、E、F 和 G 8 种亚型及 2 个流行重组型 BC 和AE，其中 B′ 亚型（29％）、重组型 BC（50％）和重组型AE（15％）是主要流行亚型[1]。

由于 HIV 病毒的高度变异性，针对各亚型gp41 蛋白表位的特异性抗体有一定差异，使用HIV 抗体检测试剂盒检测患者血清中的 HIV-1 gp41 抗体会出现假阴性结果。如研究显示，目前所用的几种抗体检测试剂盒检测 A 亚型 HIV 病毒感染者血清敏感性较低。因此，加强对 HIV-1 各亚型 gp41 蛋白表位的比较研究对提高现有检测试剂盒的免疫反应性具有重要意义。

在前期工作中，我们表达了几种我国 HIV-1主要流行亚型的 gp41 蛋白，对这些蛋白进行免疫反应性和特异性的测定，根据测定结果对 gp41 基因表位进行筛选和整合[2-5]，优化出一条含多亚型表位的 gp41 基因片段。本实验在前期工作的基础上，将 gp41 基因片段的 N 端引入一段融合基因，通过大肠杆菌原核表达方式获得溶解性较好、特异性和免疫反应性均较高的重组蛋白，为 HIV 体外血清学诊断提供原料，也为进一步研究 HIV-1 gp41蛋白表位的功能打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1质粒和菌种 含部分心肌钙蛋白（cTnI）基因的表达质粒 E1 由本公司构建并保存；宿主细胞DH5α、BL21DE3 由本公司保存；含优化的 HIV-1 gp41 基因质粒 X1 由本公司前期构建并保存。

1.1.2主要试剂 国家药品生物制品检定所 HIV参考血清（批号：20081201）由本公司保存；HIV 抗体测定反应板 HIV plate 由本公司生产并保存；1000 份 HIV 确证阴性血清由本公司保存；含部分cTnI 基因（与 E1 质粒中 cTnI 基因相同）与HIV-2 gp36 基因的重组蛋白 CP1 由公司制备并保存；HIV-1 gp41 蛋白 X1 由公司制备并保存；辣根过氧化物酶（HRP）标记鼠抗人二抗 IgG-HRP由本公司制备并保存；HIV-1 阳性血清、HIV-2 gp36单抗（monoclonal antibody，McAb）CN2、HIV-1 gp41 McAb GP47 由公司制备并保存。

1.2 方法

1.2.1引物设计 根据 X1 基因序列相关资料，设计一对 PCR 引物，上游引物 P1：5′ GCGGGATC CGCAGTGGGAATAGGAGCTTTG 3′，下游引物P2：5′ GCGCTCGAGCAATAATTCTTGTTCATTCT T 3′。扩增 gp41 基因片段的上游引物引入 BamH I酶切位点，下游引物中引入 Xho I 位点。

1.2.2基因扩增及纯化 以 X1 质粒为模板，加入相应的引物、DNTP、LA Tag 聚合酶进行 PCR扩增，反应条件为 94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃1 min，共 30 个循环。使用生工生物工程（上海）有限公司 UNIQ-10 柱式 PCR 产物纯化试剂盒纯化 PCR 产物。

1.2.3表达载体构建 纯化后的各 PCR 产物经BamH I 和 Xho I 酶切后，2％ 琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，使用生工生物工程（上海）有限公司UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒纯化回收，连入表达载体 E1，构建克隆质粒 E1-1，将其转化入DH5α 细胞中，筛选阳性克隆，使用生工生物工程（上海）有限公司 UNIQ-10 柱式质粒小量抽提试剂盒提取阳性克隆质粒，并将其转化至 BL21DE3中。

1.2.4重组蛋白的表达与纯化 将含有重组质粒的 BL21DE3 菌株接种于含有氨苄青霉素钠（50 μg/ml）的 8 ml LB 培养基中，37 ℃ 培养过夜；次日，按 1∶100 扩大培养至A600 = 1.0 时，加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，继续培养 3 h。收获细菌，菌体悬浮于 PBS 中（140 mmol/L NaCl，10 mmo1/L Na2HPO4·12H2O，1.8 mmol/L KH2PO4，2.7 mmol/L KCl，pH 7.5），冰浴下超声破菌，取少量上清和沉淀进行 12％ SDS-PAGE 电泳。收取超声后的上清，按 Qiagen 公司的 Ni-NTA Agaros 纯化步骤进行表达蛋白的纯化。

1.2.5重组蛋白包被活性检测 间接 ELISA 方法检测活性，取上述 1.2.4 步骤纯化后的重组蛋白用 PBS 稀释至终浓度为 0.5 μg/ml，包被微孔反应板，包被量为 100 μl/孔，取 CP1 和 X1 蛋白按相同条件包被作为阴性和阳性对照，包被板置 4 ℃过夜，次日加入 5％ 脱脂奶粉 200 μl/孔，置 37 ℃封闭 2 h，检测的一抗为 HIV-1 阳性血清、CN2 McAb、TP47 McAb、HIV 阴性血清（单抗稀释度为 l∶5000），二抗为 IgG-HRP，吸光度（A）由酶标仪在 630 nm 和 450 nm 双波长下测定。

1.2.6重组蛋白接酶活性检测 将重组蛋白E1-1 用 PBS 稀释至终浓度为 5 mg/ml，标记HRP[6]，配套 HIV plate 双抗原夹心法检测 1000 份HIV 阴性血清和国家药品生物制品检定所 HIV参考血清。

1.2.7血站临床实验 按上述 1.2.6 步骤，生产配套 HIV ELISA 检测试剂，以此作为考核试剂，以国外某公司生产的人类免疫缺陷病毒抗体（HIV1 + 2）及抗原（HIV1p24）联合检测试剂盒作为参比试剂，检测 8085 份确证阴性血样。

2 结果

2.1 gp41 基因 PCR 扩增及重组子鉴定

使用引物 P1、P2 进行 PCR 扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见扩增产物约 450 bp 的DNA 片段（图1），大小与预期设计相同。重组质粒经 BamH I 和 Xho I 双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析显示重组质粒被切成大小约 5900 bp 的表达载体 E1 和 450 bp 的 gp41 截短基因（图1），与预期一致。

图1 gp41 片段琼脂糖凝胶电泳鉴定Figure l Identification of gp41 gene fragment by agarose gel electrophoresis

2.2 重组菌的表达鉴定及纯化

E1-1 重组菌裂解产物进行 SDS-PAGE 电泳分析，显示诱导的重组菌裂解产物在大小约 37 kD的位置出现一条高浓度的 gp4l 融合蛋白区带（图2），与预期大小一致，经可见光扫描分析，表达产物占菌体总蛋白量约 29.5％。

SDS-PAGE 电泳显示大部分目的蛋白存在于裂解上清，经 Ni-NTA Agaros 纯化，仅有少量蛋白质残留在穿过液中，大部分目的蛋白被纯化基质特异性吸附，经洗涤液清洗后，大部分目的蛋白由洗脱液洗出，经可见光扫描分析，目的蛋白纯度约为95.1％。

2.3 重组蛋白包被活性鉴定

间接 ELISA 方法检测各一抗标本，如表 1 所示，重组蛋白 E1-1 与 HIV-1 阳性血清反应、与TP47 McAb 反应、与 HIV 阴性血清无明显反应，检测结果与阳性对照板一致。

2.4 重组蛋白接 HRP 敏感性和特异性鉴定

1000 份 HIV 阴性血清检测结果显示有 1 份血清A值为 0.303，呈假阳性反应，其余血清均为阴性反应，特异性为 99.9％。HIV 参考血清中有HIV-1 型阳性血清 18 份（P1-P18），阴性血清20 份（N1-N20），灵敏度血清（S1-S6），如表 2 所示，检测阳性血清A值均较高，检测阴性血清有1 份呈假阳性（N18）。

图2 SDS-PAGE 鉴定重组蛋白的表达及其纯化Figure 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expressed in E.coli and purified by Ni-NTA

2.5 临床实验

以参考试剂为标准，考核试剂的阴性符合率为100％（8080/8080），其中 5 例不一致样本考核试剂检测为阴性，参比试剂检测为阳性，这 5 例样本经确认后，均为阴性。最终考评结果，考核试剂的阴性符合率为 100％（8085/8085），参考试剂阴性符合率为 99.9％（8080/8085）。

3 讨论

当前，国内 HIV 体外诊断试剂产品质量有了很大提高，但与国外同类试剂相比假阳性率高、漏检现象较多，究其原因主要是原料蛋白的质量较差。一方面由于HIV亚型 gp41 基因间的差异，针对 gp41 蛋白的抗体具有型特异性，使用含单一亚型 gp41 表位的蛋白检测HIV感染者血清会出现漏检现象；另一方面，为了提升检测试剂的免疫反应性而增加蛋白的使用量或种类，结果导致检测的特异性下降、假阳性率增高。

表1 重组蛋白包被活性检测Table 1 ELISA detection of antigens coated by the recombinant protein

表2 国家药品生物制品检定所 HIV 参考血清检测结果Table 2 ELISA detection of national drug testing of biological products inspection institute HIV panel

根据我们对HIV体外诊断使用原料的研究发现，选择 gp41 表位的同时，需要对表达载体进行选择，如利用不同表达载体表达的 gp41 融合蛋白在免疫反应性和特异性上有一定的差异，因此提高原料的质量不仅要选择好 gp41 表位，还要选择正确的融合基因。为了提升原料蛋白的质量，我们采取的设计方案是首先将目前 HIV 主要流行亚型表位串联在一起，其次找到一段保守基因与之融合。前期工作中，通过对目前我国 HIV 流行病学的研究，我们确认 BC 重组亚型和 AE 重组亚型为主要流行亚型，通过对两种分离株 CRF-01、CRF-08基因的分析和比对，利用基因工程方法对其 gp41基因进行改造，选取保守性强的高表位区，对易引起非特异性的某些高表位区进行基因突变，最终优化出一条含有多亚型表位的 gp41 基因片段。在融合基因的筛选实验中，我们选择了 dsbA、Trx、MBP、GST、cTnI 等五个蛋白的部分基因，分别与两种亚型的 gp41 基因融合表达，通过活性检测比较，cTnI 作为融合肽表达的融合蛋白表位暴露充分、特异性好。

为了获得敏感性强、特异性高的 HIV 体外诊断用原料，本实验在前期工作基础上，独创性地将部分 cTnI 基因与 HIV gp41 基因融合，融合基因成功克隆入大肠杆菌并在上清中得到了高效表达，通过金属螯合亲和层析纯化，重组蛋白纯度达到95％ 以上，达到体外诊断试剂对原料纯度的要求。重组蛋白经包被反应板，间接 ELISA 检测显示对HIV-1 阳性血清具有较高的免疫反应性，确证所表达重组蛋白的正确。我们将重组蛋白进行 HRP 标记，与 HIV plate 反应板配套进行了一系列实验，结果显示，检测 1000 份 HIV 阴性血清标本特异性达 99.9％，检测国家药品生物制品检定所 HIV参考血清样本显示出较好的特异性和免疫反应性，在临床实验中与国外同类试剂的比较也表现较优。综上，本次实验达到预期的目标，所获得的重组蛋白可作为原料用于生产 HIV 体外检测试剂。

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Expression and purification of recombinant HIV-1 gp41 pr otein and determination of its immunoreactivity

LIANG Quan, LUO Chun-zhen, MAO Pei-ju, WANG Man

ObjectiveExpressions of HIV-1 gp41 antigen for in-vitro immunoassay.MethodsHIV-1 gp41 gene was amplified by PCR by using the plasmid X1 as a template, and then inserted into the plasmid E1 to construct recombinant plasmids E1-1. The expression of the recombinant plasmid in competent E.coli cell Bl21DE3 was induced with IPTG and analyzed with SDS-PAGE. After being purified by Ni-NTA affinity chromatography, the recombinant protein was further evaluated with ELISA for their functional characteristics.ResultsThe result from SDS-PAGE showed expression of E1-1 in the competent E.coli cell. The purity of the purified recombinantprotein was over 95％, and the protein has excellent immunoreactivity and specificity with ELISA.ConclusionsRecombinant protein E1-1 can be expressed with a high immunoactivity, which can be qualified for HIV ELISA production.

HIV-1; Recombinant proteins; Immunocompetence

WANG Man, Email: wangman@skhb.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.004

200233 上海科华生物工程股份有限公司

王缦，Email：wangman@skhb.com

2011-10-14

方法以含 HIV-1 gp41 基因的质粒 X1 为模板，采用PCR 方法扩增出 gp41基因，克隆入 E1 载体构建重组表达质粒 E1-1，转化 E.coli BL21DE3 感受态细胞，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，使用镍螯合琼脂糖亲和层析柱（Ni-NTA Agaros）纯化重组蛋白，通过 ELISA法检测重组蛋白的免疫反应性和特异性。

结果SDS-PAGE 鉴定结果表明，重组 E1-1 蛋白获得了正确的表达；纯化的重组 E1-1 蛋白纯度 ＞ 95％；ELISA 检测结果表明，重组 E1-1 蛋白具有较优的免疫反应性和特异性。结论 成功表达出具有较高免疫反应性的重组 E1-1 蛋白，可应用于 HIV 体外检测试剂。

Author Affiliation:Shanghai Kehua Bio-engineering Co., Ltd (KHB), Shanghai 200233, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):415-419