缺血性脑损伤与内源性神经干细胞研究进展

张 钰，高剑峰，2

(1.郑州大学第三附属医院儿科 河南郑州 450052;2.河南中医学院生理学科 河南 郑州 450008)

缺血性脑损伤是临床上最常见的神经系统疾病，致残率和致死率均较高，存活者因神经元丢失而出现神经功能障碍。对缺血性脑损伤的治疗目前主要采用支持与对症治疗，维持生命体征的稳定。临床上采用的神经营养药物或者神经生长因子的临床疗效未获得国际认可。神经干细胞因具有增殖、分化和替代受损神经元促进神经功能恢复的作用，是目前国内外研究的热点。哺乳动物包括人类的大脑神经干细胞主要存在于海马齿状回颗粒下层(Dentate gyrus，DG)、侧脑室室管膜(Ventricular zone，VZ)及室管膜下区(Subventricular zone，SVZ)两个主要聚集区域，SVZ区新生的神经元可通过嘴侧迁徙流(rostral migratorystream，RMS)移至嗅球和皮层，DG区新生的神经元可移至海马颗粒层［1］。机体在缺血性损伤的刺激下，一方面导致大量的神经元死亡，但是另一方面作为机体的保护反应可以刺激内源性神经干细胞的增殖、分化，促进受损脑组织的结构与功能重建。但是，由于损伤刺激神经干细胞增生的数量有限，并且大部分在1个月左右死亡，不利于神经功能的恢复。而外源性干细胞移植对其疗效和可行性以及潜在的副作用争议较大。因此，通过不同途径和策略动员内源性干细胞适时的增殖、分化并抑制其死亡可能是促进脑损伤后神经功能修复的有效途径。

1 神经干细胞的生物学特征

神经干细胞(NSC)具有自我复制能力，生理状态下可以进行对称性分裂，产生的子细胞均是干细胞，亦可以通过非对称分裂产生一个保持亲代特征的干细胞和另一个可向多个细胞系终末分化的祖细胞，其机制与细胞浆中调节分化蛋白的不均匀分配有关，分裂后NSCs通过对称性分裂来增加细胞的数量，通过非对称分裂产生各种细胞系。健康成年大鼠脑组织中，NSC非对称性分裂占55%，对称性分裂为40%［2］。在不同生理和病理因素刺激下，可分别向神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞分化。

2 神经干细胞的增殖、迁移和分化

啮齿类动物和人类神经干细胞主要存在于VZ、SVZ及DG等区域［3］。SVZ的神经干细胞包括A、B和C型细胞3个细胞亚群。其中，B型细胞有B1和B2两种亚型。A型细胞为神经前体细胞，分裂周期频繁。B型细胞是星形胶质细胞，镜下排列方式多呈链状，B1细胞多位于A型细胞和室管膜细胞之间，构成组织学上胶质边界，而B2型细胞则位于A型细胞和纹状体之间，构成二者之间胶质边界。C型细胞的增殖频率非常活跃。脑缺血性损伤刺激可促进A型和C型细胞的数目明显增加，对B型细胞的活化也有很强的刺激作用。用有丝分裂阻断剂Ara－C干预后，A型和C型细胞几乎完全消失，但B型细胞不受影响。在脑缺血后，A型和C型细胞在停用Ara－C 7 d后完全恢复，非缺血组则需14 d才能恢复，提示B型细胞是一种相对静息状态的神经干细胞。Ara－C阻断A和C型细胞之后，B型细胞分裂，产生新的C型细胞，后者产生A型细胞，重建SVZ的增殖细胞群［4－5］。脑缺血后对称性分裂的比例增加，向神经元表型分化增多，脑缺血14 d后，对称性分裂比例回降，表明脑缺血可以暂时性地增加对称性分裂的细胞比例，扩大前体细胞源，并促进其向神经元方向分化［6］。

生理状态下，SVZ的NSC经RMS迁移到嗅球［7］。脑缺血后，SVZ的NSC可呈链状迁移至缺血灶周边区域，迁移细胞聚集成群，然后分散开并且生成树枝状突起。SVZ的B2型细胞因位于NSC和其下方的纹状体之间，对NSC的迁移构成物理屏障。脑缺血刺激可减弱物理屏障作用，促进NSC向缺血灶迁移。NSC迁移到脑缺血灶周边区域之后，在局部微环境刺激下分化为与周围脑组织相适应的成熟的神经元，与邻近的神经元形成新的突触结构，参与神经网络的重新构建，促进结构整合和功能恢复。内源性神经干细胞迁移中，可特异性表达DCX抗原。DCX+细胞胞体较小，有着单极或双极的突起，是正在迁移过程中的不成熟的神经前体细胞。局灶性脑缺血后，SVZ区新生的细胞可离开RMS向损伤同侧的纹状体梗死区迁移，这些细胞中的一部分最终分化为纹状体成熟的神经元和星型胶质细胞［8］。另有研究发现，损伤同侧SVZ区的一些NSC向胼胝体和损伤区周边皮质迁移［9］。生理状态下，SGZ区的NSC主要向GCL迁移，缺血性损伤后依然没有改变。TaNaKa等［10］观察到了脑缺血后DG的中NSCs迁移，第5 d时GCL的新生细胞开始增加，到第30 d新生细胞中只有极少数仍位于SGZ，绝大多数最终移行到GCL，表达成熟神经元标志物，并具有和正常颗粒细胞相同的生长过程，能与周围环境进行整合。

3 脑缺血后内源性神经再生调节修复

3.1 神经干细胞增殖水平的调节 生理状态下，兴奋性氨基酸可刺激相应跨膜信号转导系统参与NSC的增殖分化，兴奋性氨基酸受体活性下降可抑制脑缺血诱导的NSC增殖及突触重塑效应［11］。NMDA受体拮抗剂可有效抑制兴奋性氨基酸毒性改变脑内微环境，降低胞浆内Ca2+浓度，通过bcl-2抑制神经细胞凋亡，同时刺激表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达，促进干细胞向神经元分化。脑缺血可刺激多种生长因子和细胞因子的表达，通过各自的信号转导通路激活NSC。缺血性脑损伤时，bFGF促使神经干细胞向成熟神经元方向分化增多，潜伏期短且持续时间长，EGF促进神经前体细胞的增殖和分化作用主要发生在NSC增殖晚期，且bFGF早期作用提高了NSC增殖晚期对其他生长因子的作用效果，呈现增敏效应［12］。此外，脑缺血后碱性成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和干细胞因子(SCF)及其各自信号转导受体表达均显著提高，尤其SVZ和SGZ区域表达升高更为明显。将SCF注入侧脑室，SVZ和SGZ区的BrdU阳性细胞数明显增加，神经元分化比率提高［13］。脑缺血后神经生长因子(NGF)和BDNF表达上调，其受体活性及数目也有相应提高，梗死周边区神经元方向分化率提高，向梗死周边迁移比例增加，突触可塑性明显提高，其促NSC增殖分化及新生神经元存活的作用呈现时间依赖性［14］。但也有报道称BDNF的表达并不能促进脑缺血后神经的再生，Larsson等［15］将携带有BDNF基因的腺相关病毒载体注入海马后，BDNF在海马的长期表达并没有促进海马的神经再生，反而抑制齿状回颗粒细胞的再生，其具体详细机制还有待进一步研究。

3.2 神经干细胞存活水平的调节修复 脑损伤可激发缺血及周边区域脑组织产生炎症反应，炎症与脑缺血后的神经再生有关［16］。Yamada等［17］研究离子通道发现，干细胞增殖受Ca2+通道以及细胞Ca2+水平变化的调节，脑缺血后缺氧以及炎性因子可刺激Ca2+通道持续开放，引起细胞外液Ca2+内流，也激活了很多Ca2+信号转导通路，促进细胞分裂后存活因子的表达和释放，激活NSC进入细胞周期。5-HT是缺血性脑损伤炎症反应释放增多的炎性因子之一，有效抑制5-HT合成或选择性破坏5-HT神经元均可减少海马齿状回和侧脑室下区新生细胞的数量。脑缺血缺氧可诱导EPO在星形胶质细胞的表达，同时EPO受体在侧脑室下区的表达也升高。脑缺血后脑内EPO及其受体水平的升高是一种内在的保护反应，EPO也参与缺血后内源性干细胞的激活［18］，有助于NSC向新生神经元的分化和脑缺损功能的恢复。神经细胞凋亡的变化在神经再生中也发挥作用，Ekdahl等给予脑缺血成年大鼠侧脑室注射caspase抑制剂，结果显示抑制剂可使DG区BrdU阳性细胞数目增多，而TUNEL阳性细胞显著减少，提示采取有效措施拮抗新生细胞的凋亡可以增加该区增殖细胞的数量［19］。

3.3 迁移和分化水平的调节修复 促进内源性神经干细胞向受损脑区迁移、定向分化、补充和替代缺失的神经元，发挥内源性修复作用是利用内源性NSC治疗脑损伤的主要方向。多唾液酸－神经粘附分子(PSANCAM)可介导细胞的粘附和识别，促进神经前体细胞迁移、轴突生长和突触连接，是脑损伤后NSC可塑性的重要调节因子，常作为检测脑缺血后神经干细胞的数量及其增殖、迁移的指标［20］。Hayashi等采用大鼠MCAO模型，发现MCAO 90 min再灌注1 h后，梨状皮层开始出现PSA-NCAM阳性细胞，再灌注8 h后MCA供血区域的皮质和尾状核开始表达PSA-NCAM，提示脑损伤后脑皮质和尾状核神经元具有可塑性变化的能力［21］。Reelin是一种细胞外基质蛋白，reelin与受体VLDLR、ApoE R2和整合素结合后，调节细胞与细胞以及细胞与基质之间的黏附分子，与神经元的正确迁移以及大脑的正常发育有关。Golan采用孕鼠缺氧模型，观察胚胎期缺氧对新生鼠神经再生及迁移的影响，发现缺氧后2 h内Reelin表达减少并可持续24 h，经过MgSO4预处理后，海马区新生细胞 Reelin表达增加，DG和CA1区的神经干细胞迁移增多，提示妊娠缺氧可通过影响神经细胞迁移，导致出生后长期神经发育及功能障碍［22］。Nishino等［23］利用体外多巴胺能神经元培养技术，发现多巴胺耗竭区组织的提取物中bFGF及GDNF活性比正常脑区明显增高，将提取物刺激培养神经元细胞，神经元的存活率得到了提高，其轴突的延伸和胞体树突的扩增都有了较大发展，推测GDNF及bFGF异常增高的活性可能是多巴胺耗竭区NSC生存与分化的环境诱导信号。

4 外在因素对神经干细胞增殖与分化的影响

开展内源性NSC的康复干预规律研究，对促进缺血性脑损伤的中枢神经结构再生和重建及功能恢复起到积极的作用。高压氧可有效抑制脑缺血炎性反应，减少“半影区”脑组织坏死和细胞凋亡，减轻脑组织水肿和梗死体积，神经功能障碍得到恢复，其机制可能和促进脑内神经营养因子等的表达、促进内源性神经干细胞的激活有关［24］。Kim 等［25］利用沙土鼠脑缺血模型，发现针刺“足三里”穴可使齿状回中细胞增殖数量明显增加，电针大鼠双侧“合谷”穴区能使局灶脑缺血/再灌注后SVZ和DG区神经干细胞增殖更明显，且病灶侧多于病灶对侧、病灶周围分布密集，随着治疗时间增加细胞增多更明显，且神经干细胞迁移轨迹呈立体模式。我们的实验研究也发现，电针穴位刺激能够促进幼年正常大鼠神经干细胞的增生以及向神经元分化［26］。电磁场对神经干细胞分化的调控也处于探讨中，新生大鼠脑神经干细胞分别置于5 Hz和20 Hz正弦交变磁场(8 mT)中诱导分化，发现干细胞向神经元表型分化比率升高，且随20 Hz电磁场干预时程的延长逐渐增高［27］。我们对临床剂量的磁共振对神经干细胞的影响进行探讨，并未发现磁共振对神经干细胞的增生以及分化有明显影响［28］，但是，放射线以及临床常用的麻醉药异氟醚能降低神经干细胞的数量，减少神经元的再生，并且对未成熟脑的影响更明显［29－30］。

5 结语

脑缺血可以激活自体的NSC增殖、存活、迁移、分化，但增殖的NSC数量有限，而且调节NSC存活、迁移、分化以及神经元修复和突触形成的作用机制尚处于探索阶段。如何增加内源性神经发生，如何诱导NSC向损伤脑区迁移、向神经元方向分化并整合到神经环路，如何避免体内抑制神经发生的因素，如何防止新生神经元的凋亡等都有待研究。但是，积极寻找并扩增内源性干细胞池、促进迁移、分化及子代存活的有效方法，使NSC增殖、向受损脑区迁移、定向分化、补充和替代缺失的神经元，发挥内源性修复作用是利用内源性NSC促进神经功能康复的主要措施。

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