鸡蛋壳膜提取唾液酸过程中蛋白质脱除工艺优化

丁 龙，陶 旭，张 燕，苏 薇，陈 铭，刘 畅，刘静波*

(吉林大学营养与功能食品实验室，吉林 长春 130062)

鸡蛋壳膜提取唾液酸过程中蛋白质脱除工艺优化

丁 龙，陶 旭，张 燕，苏 薇，陈 铭，刘 畅，刘静波*

(吉林大学营养与功能食品实验室，吉林 长春 130062)

以鸡蛋壳膜为原料，用乙醇沉淀法脱除蛋白质以提取唾液酸。利用二次回归中心组合设计对影响蛋白质去除率和唾液酸回收率的乙醇体积分数、加热温度、加热时间、pH值4个因素进行回归分析和优化，建立四元二次回归模型。结果表明因素的影响大小顺序为：乙醇体积分数＞加热温度＞pH值＞加热时间，确定最佳工艺参数为：乙醇体积分数30%、加热温度80℃、加热时间1h、pH2。在此条件下，蛋白质去除率为52.3%，唾液酸回收率为82.1%，经验证实验得到实验结果与模型预测值吻合，说明建立的模型确实可行。

鸡蛋壳膜；唾液酸；蛋白质；响应面法

唾液酸(sialic acid，SA)是一类神经氨酸的衍生物，是以九碳酮糖酸-神经氨酸为骨架，并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，通常在糖蛋白和糖脂的末端以糖苷的形式存在[1]。唾液酸广泛分布于自然界中，但以哺乳动物大脑和乳液中含量最多[2]，因其与神经系统的发育[3]、记忆与学习能力形成[4]、细胞识别与信息传递[5]等有紧密联系而成为研究热点。唾液酸在分子生物学[6]和化学合成[7]中的研究已多见报导，但关于唾液酸的生物提取因其活性成分复杂、含量少而比较困难，Blix等[8]用较为温和的水解方法从颌下腺黏蛋白中首先分离出了唾液酸，后来有Juneja等[9]从禽蛋的蛋黄膜和系带中提取出唾液酸等，高剑峰等[10]曾报导了以猪血为原料提取唾液酸的工艺，李文强等[11]研究了从大肠杆菌发酵液中分离纯化得到聚唾液酸的工艺等。

我国是禽类养殖大国，鸡蛋的食用多为传统的直接食用方法，每年约有400万吨废弃鸡蛋壳造成资源的浪费以及生态环境的严重污染[12]。而鸡蛋壳膜中唾液酸的含量相当可观，约为0.02%[13]，本实验以鸡蛋壳膜为原料，经过水解，然后用乙醇沉淀法除去水解液中占绝大部分的蛋白质以提取唾液酸。采用响应面设计法考察乙醇体积分数、加热温度、加热时间和pH值及其交互作用对试验结果的影响，通过建立四元二次回归模型确定最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋壳 吉林大学农学部学生一食堂；牛血清白蛋白(分子生物学级) 美国Amresco公司；唾液酸标准品、考马斯亮蓝G-250 美国Sigma公司；水合茚三酮、冰乙酸(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、盐酸、硫酸(均为分析纯) 北京化工厂；浓磷酸(分析纯) 天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津公司；R-250型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司；AG204型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；CR20B2型高速冷冻离心机 日本日立公司；PHS-3B精密pH计 上海雷磁公司；FN-200高速万能粉碎机 宁波薪芝公司；Cs501sp型超级恒温器 上海虹锦屏有限公司通洲分公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡蛋壳膜中唾液酸提取工艺流程

鸡蛋壳→清洗→壳膜分离→鸡蛋壳膜→干燥、粉碎→水解→真空抽滤→减压浓缩→乙醇沉淀蛋白→离心去沉淀→样品

1.3.2 蛋白质的定量检测

采用考马斯亮蓝结合法测定样品中蛋白质含量[14]。

1.3.4 因子贡献率计算公式

式中：β为因子贡献率/%；sj和fj分别为试验因素j的偏差平方和与自由度；se和fe分别为误差的偏差平方和与自由度；s为总偏差平方和。

1.3.5 试验设计

乙醇的加入能改变蛋白质溶液的介电常数导致蛋白质溶解度下降，同时加热能促使蛋白质变性沉淀。本试验通过向减压浓缩后的鸡蛋壳膜水解液中加入适量无水乙醇，选择无水乙醇添加量、加热温度、加热时间和溶液pH值为试验因素。先以单因素试验初步确定对蛋白质去除率有显著影响的各因素水平范围，然后进行二次正交中心组合设计试验。

1.3.5.1 单因素试验

固定加热温度8 0℃、p H 3、加热时间1 h，考察乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%时对蛋白质去除率的影响，以确定适宜的乙醇体积分数。

固定乙醇体积分数40%、pH3、加热时间1h，考察加热温度分别为50、60、70、80、90℃时对蛋白质去除率的影响，以确定适宜的加热温度。

固定乙醇体积分数40%、加热温度80℃、pH3，考察加热时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5h时对蛋白质去除率的影响，以确定适宜的加热时间。

固定乙醇体积分数40%、加热温度80℃、加热时间1h，考察pH1、2、3、4、5时对蛋白质去除率的影响，以确定适宜的p H值。

1.3.5.2 二次正交中心组合设计试验

选择4个因素χ1(乙醇体积分数)、χ2(加热温度)、χ3(加热时间)、χ4(pH值)为自变量进行组合试验设计。根据单因素试验结果，设计二次中心组合设计试验因素编码表，如表1所示，试验均按随机顺序进行。利用Design Expert软件中的Central Composite进行乙醇体积分数、加热温度、加热时间和pH值4个因素对蛋白质去除率和唾液酸回收率的响应面分析，并对获得的回归模型进行显著性检验。

表1 鸡蛋壳膜提取唾液酸过程中蛋白质脱除工艺二次组合设计因素编码表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 蛋白质和唾液酸测定标准曲线回归方程

吸光度A595与蛋白质质量浓度(C)/(μg/mL)的相关标准曲线回归方程：A595＝0.0062C＋0.0859，相关系数R2＝0.9978，吸光度A470与唾液酸质量浓度(C)/(μg/mL)的相关标准曲线回归方程：A470＝0.0022C-0.0073，相关系数R2＝0.9989，在试验范围内线性关系均良好，能满足本试验需要。

2.2 单因素试验结果分析

图1 各因素对蛋白质去除率的影响Fig.1 Effect of each factor on protein removal rate investigated by onefactor-at-a-time design

由图1可知，当乙醇体积分数在20%～60%之间增加时，蛋白质去除率有明显增大，乙醇体积分数60%时的蛋白质去除率约是30%时的2倍；当加热温度在50～90℃之间、pH值在1～5之间增大时，蛋白质也有较明显的增大，但增加幅度没有乙醇体积分数大；加热时间在0.5～2.5h之间增大时，蛋白质去除率呈上下波动变化趋势，且波动幅度不明显，说明加热时间对乙醇去除率的影响不显著。

2.3 回归模型的建立

利用Design Expert软件对表2的试验数据进行回归分析，得到回归模型如下：

表2 鸡蛋壳膜提取唾液酸过程中蛋白质脱除工艺二次中心组合设计试验方案与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.1 回归模型检验

蛋白质去除率回归模型(式4)的方差分析表明(表3)，此模型的决定系数R2＝0.8337，响应面回归模型接近高度显著水平(P＝0.0013)，逐步显著性检验结果表明，交互项对回归模型影响不显著，二次项有显著影响，一次项有极显著影响，决定系数为0.5887，对回归模型系数的显著性检验表明，χ3、χ1χ3、χ2χ3、χ2χ4、χ3χ4不显著，χ1χ2、χ12、χ22、χ32在可以接受的水平，χ1、χ2、χ4、χ1χ4、χ42显著，其中χ1为高度显著性。回归模型失拟项P＝0.1110＞0.05，不显著，说明该回归模型能够很好的拟合试验结果。

唾液酸回收率回归模型(式5)的方差分析表明(表3)，此模型的决定系数R2＝0.9665，响应面回归模型达到高度显著水平(P＜0.0001)，逐步显著性检验结果表明，交互项对回归模型影响不显著，二次项和一次项有极显著影响，决定系数达到0.72641，对回归模型系数的显著性检验表明，χ3、χ1χ4、χ3χ4、χ32不显著，χ4、χ1χ2、χ2χ4在可以接受的水平，χ1、χ2、χ1χ3、χ2χ3、χ12、χ22、χ42均达到显著性水平，且χ1、χ12为高度显著性。回归模型失拟项P＝0.8128＞0.05，不显著，说明该回归模型能够很好的拟合试验结果。

表3 二次响应面回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the created regression models for protein removal rate and sialic acid recovery

2.4 回归模型的分析

2.4.1 因子贡献率

采用因子贡献率来比较各因子对试验结果影响的大小。各因子贡献率见表4，可以看出，线性项和二次项是回归模型的主导效应。对于蛋白质去除率，各试验因素的效应影响大小顺序为χ1(乙醇体积分数)＞χ4(pH值)＞χ2(加热温度)＞χ3(加热时间)，对于唾液酸回收率，各试验因素的效应影响大小顺序为χ1(乙醇体积分数)＞χ2(加热温度)＞χ4(pH值)＞χ3(加热时间)。

表4 各因子贡献率表Table 4 Contribution rate of each term in the created regression models to protein removal rate and sialic acid recovery

2.4.2 单因素效应分析

图2 各单因素水平与蛋白质去除率的回归曲线Fig.2 Effect of each factor on protein removal rate investigated based on the created regression model

由因子贡献率分析得到，对回归模型影响最大的是各因素的一次效应，即单因素。控制4个因素中的3个因素在零水平，分别得到各个因素的单因素模型，各因素的单因素效果图见图2、3。从图2、3可以看出，随着乙醇体积分数、加热温度和pH值的增大，蛋白质去除率随着增大，但唾液酸的回收率却随之降低，其中乙醇体积分数对蛋白质去除率和唾液酸的回收率的作用均最显著，加热温度和pH值次之，而加热时间的变化对蛋白质去除率和唾液酸回收率几乎没有影响。

图3 各单因素与唾液酸回收率的回归曲线Fig.3 Response surface plots showing the interactive effects of four factors on protein removal rate

2.4.3 交互作用效应分析

图4 各交互因素对蛋白质去除率影响的响应面图Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of four factors on sialic acid recovery

以蛋白质去除率为响应值，对乙醇体积分数、加热温度、加热时间和pH值4个因素作响应面图，见图4。从图4可以看出，乙醇体积分数与加热温度、乙醇体积分数与pH值的交互效应最显著，在试验考查范围内同时增大乙醇体积分数与加热温度、增大乙醇体积分数与pH值均能使蛋白质去除率迅速增大，并接近最大值，而且响应值对乙醇体积分数的变化比加热温度和pH值都要敏感很多，其最优点分别趋近于乙醇体积分数70%与加热温度80℃、乙醇体积分数70%与pH6。其他交互作用效应并不很显著，其最优点分别为：乙醇体积分数70%与加热时间1h、加热温度80℃与加热时间1h、加热温度80℃与pH6、加热时间1h与pH6，并且响应值分别在这些点附近达到最大值。

以唾液酸回收率为响应值，对乙醇体积分数、加热温度、加热时间和pH值4个因素作响应面图，见图5。从图5可以看出乙醇体积分数与加热温度、乙醇体积分数与加热时间、加热温度与加热时间、加热温度与pH值的交互效应显著，响应值对乙醇体积分数的变化最为敏感，当乙醇体积分数增大时，响应值显著减小，即在试验范围内，当乙醇体积分数越小时，唾液酸回收率越高。同时减小乙醇体积分数与加热温度、乙醇体积分数与pH值对唾液酸回收率的促进均有显著作用。

图5 各交互因素对唾液酸回收率影响的响应面图Fig.5 Response surface of each factors on the sialic acid recovery rate

2.5 回归模型寻优

分别对蛋白质去除率和唾液酸回收率的四元二次多项式数学模型解逆矩阵，蛋白质去除率的最佳工艺参数为：乙醇体积分数52.6%、加热温度79.6℃、加热时间1.1h、pH2.2，预测的最大蛋白质去除率为54.9%；唾液酸回收率的最佳工艺参数为：乙醇体积分数51.9%、加热温度77.4℃、加热时间0.7h、pH3.9，预测的最低唾液酸回收率为66.57%。而利用Design Expert Numerical Optimization对蛋白质去除率和唾液酸回收率的回归模型进行寻优，得到使蛋白质去除率最大时的工艺参数为：乙醇体积分数66.4%、加热温度61.5℃、加热时间0.7h、pH6.0，蛋白质去除率为71.0%，使唾液酸回收率最大的工艺参数为：乙醇体积分数23.7%、加热温度47.5℃、加热时间1.3h、pH2.3，唾液酸回收率接近100%。由于乙醇对蛋白质去除率的影响最大，要使蛋白质有较大的去除率，就必须使用比较大的乙醇体积分数，而较大的乙醇体积分数又会造成唾液酸回收率的下降[16]，因此综合考虑蛋白质去除率和唾液酸回收率，结合实际，确定比较合适的工艺参数为：乙醇体积分数30%、加热温度80℃、加热时间1h、pH2，预测的蛋白质的去除率为52.3%，唾液酸回收率为82.1%。

3 结 论

利用二次正交中心组合设计，通过Design Expert软件中的 Central Composite对影响蛋白质去除率和唾液酸回收率的乙醇体积分数、加热温度、加热时间、pH值4个因素进行回归分析和优化，经F检验，该回归模型不失拟，能很好地拟合鸡蛋壳膜水解液提取唾液酸反映的真实情况，因子贡献率分析表明，各因素对唾液酸提取的影响大小顺序为乙醇体积分数＞加热温度＞pH值＞加热时间，最后综合考虑蛋白质去除率和唾液酸回收率，结合实际情况，得出唾液酸提取的最佳工艺参数为：乙醇体积分数30%、加热温度80℃、加热时间1h、pH2。这与李文强等[11]曾报导的发酵液中聚唾液酸分离纯化过程中除蛋白质的研究结果较为接近，所添加乙醇体积分数的不同可能是由于鸡蛋壳膜水解液中聚唾液酸的含量较少，而唾液酸单体较多。

[1] 李绍顺. 唾液酸及其衍生物的生物学研究进展[J]. 药学进展, 1997, 21(2): 70-76.

[2] 卢大用, 胥彬. 唾液酸研究的一些进展[J]. 生物学杂志, 1994(1): 6-8.

[3] WANG Bing, MCVEAGH P, PETOCZ P, et al. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants [J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2003, 78(5): 1024-1029.

[4] WANG Bing,YU Bing, KARIM M, et al. Dietary sialic acid supplementation improves learning and memory in piglets[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2007, 85(2): 561-569.

[5] PENG Xiaoqing, ZHANG Xiulin, FANG Yan, et al. Sialic acid contributes to hyperexcitability of dorsal root ganglion neurons in rats with peripheral nerve injury[J]. Brain Research, 2004, 1026(2): 185-193.

[6] WANG Bing, DOWNING J A, PETOCZ P, et al. Metabolic fate of intravenously administered N-acetylneuraminic acid-6-14C in newborn piglets[J]. Asia Pac J Clin Nutr, 2007, 16(1): 110-115.

[7] 李连生, 刘克刚, 姚祝军. 唾液酸类化合物的合成研究进展[J]. 有机化学, 2002, 22(10): 718-734.

[8] BLIX G, GOTTSCHARLK A, KLENK E. Proposed nomenclature in the field of neuraminic and sialic acid[J]. Nature, 1957, 179: 1088-1089.

[9] JUNEJA L R, KOKETSU M. Large-scale preparation of sialic acid from chalaza and egg-yolk membrane[J]. Carbohydrate Research, 1991, 214 (1): 179-186.

[10] 高剑峰, 冯万祥. 血液中唾液酸的提取及结晶纯化[J]. 中国医药工业杂志, 1996, 27(6): 246-247.

[11] 李文强, 詹晓北, 张丽敏, 等. 聚唾液酸分离纯化过程中脱除蛋白质工艺的研究[J]. 食品与发酵工业, 2005, 31(5): 23-26.

[12] 李彦坡, 马美湖. 蛋壳及蛋壳膜的研究和利用[J]. 粮食与食品工业, 2008, 15(5): 27-36.

[13] 李勇, 刘新民. 鸡蛋的功能性及其制品[J]. 中国食物与营养, 2001 (5): 28-29.

[14] 张琦. 聚唾液酸发酵和分离纯化工艺的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2009.

[15] 黄华军, 奚星林, 陈文锐, 等. 分光光度法检测燕窝及其制品中燕窝含量[J]. 广州食品工业科技, 2003, 19(3): 68-69.

[16] 郑志永, 李文强, 詹晓北, 等. 唾液酸溶析结晶工艺的研究[J]. 食品与发酵工业, 2006, 32(5): 59-61.

Deproteinization Optimization for Sialic Acid Extraction from Eggshell Membranes by Response Surface Methodology

DING Long，TAO Xu，ZHANG Yan，SU Wei，CHEN Ming，LIU Chang，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, Jilin University, Changchun 130062, China)

In this study, eggshell membranes were used as the raw material to extract sialic acid based on deproteinization by ethanol precipitation. A four-factor, five-level central composite design combined with multiple regression analysis was employed to mathematically model protein removal rate and sialic acid recovery as a response to ethanol concentration, temperature, heating time and pH, respectively. Ethanol concentration was identified to be the most significant affecting factor, followed by temperature, pH and heating time. The optimal deproteinization conditions were determined to be: ethanol concentration 30%, temperature 80 ℃, heating time 1 h and pH 2. Under these conditions, the removal rate of protein was predicted to be 52.3% and the recovery of sialic acid 82.1%, closely agreeing with the experimental values, respectively. Thus, the created models are reliable.

eggshell membranes；sialic acid；protein；response surface methodology

TS253.1

：A

1002-6630(2011)20-0114-07

2011-06-28

吉林大学“大学生创新性实验计划”项目(2010B83176)

丁龙(1988—)，男，本科生，研究方向为营养与功能性食品。E-mail：dinglong178@126.com

*通信作者：刘静波(1962—)，女，教授，博士，研究方向为营养与功能性食品。E-mail：ljb168@sohu.com