响应面法优化玉米两步浸泡工艺

李锁霞，闵伟红*，李鸿梅，刘 嘉，张 丹，刘景圣

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

响应面法优化玉米两步浸泡工艺

李锁霞，闵伟红*，李鸿梅，刘 嘉，张 丹，刘景圣

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

以玉米为原料，采用两步浸泡工艺提取淀粉，通过单因素试验考察第2步浸泡工艺中浸泡时间、浸泡温度和酸性蛋白酶添加量对淀粉得率的影响，并通过响应面法建立淀粉得率与浸泡时间、浸泡温度及蛋白酶添加量之间的关系。玉米浸泡的最优工艺条件：第1步浸泡温度52℃、浸泡时间3h；第2步浸泡温度51℃、浸泡时间2.25h、加酶量700U/g。拟合得到的模型较好的符合实际。该方法浸泡时间2.25h，淀粉得率64.9%。

玉米淀粉；浸泡；响应面法

浸泡工艺是玉米淀粉加工过程中所涉及的第一道也是最重要的一道工序，浸泡效果的好坏直接影响淀粉成品和其他副产品的收率、质量和成本[1]。传统玉米淀粉生产中浸泡工艺普遍采用亚硫酸在48～53℃条件，于8～12只浸泡罐逆流循环浸泡的间歇操作，浸泡时间为36～48h，1t商品玉米耗蒸汽157kg，产生0.7～1.0t稀玉米浆[2]。该方法存在浸泡时间长，生产成本高、生产效率低，耗能高，废水排放量大，同时所释放SO2气体污染环境，亚硫酸对设备和管道有强烈腐蚀作用等缺点，因此需要对传统浸泡工艺技术进行革新。

国外在上世纪70年代就有学者对浸泡工序进行研究。Perez等[3-4]在浸泡前先把玉米破碎成几块能够缩短浸泡时间，提高淀粉得率。许多学者[5-11]研究发现在浸泡液中添加乳酸或是酶制剂可以缩短浸泡时间且提高淀粉得率。Johnston等[8]报道了一种新的浸泡工艺，将整粒玉米粗磨后，加特定酶浸泡，较大程度的缩短了浸泡时间。

国内也有关于浸泡工艺的研究报道。赵寿经等[12]根据嗜热乳酸菌的发酵特性和菠萝蛋白酶的动力学特征，结合两步粉碎法，将整个浸泡时间缩短至16h；闵伟红等[13]采用复合酶和加压法联合浸泡，将整个浸泡时间缩短至15h。

本研究在筛选所需浸泡酶的种类，确定酸性蛋白酶为高效作用酶的基础上，采用两步浸泡法，并应用响应面分析对玉米两步浸泡方法进行优化，探讨缩短玉米浸泡时间，降低环境污染，提高玉米淀粉成品及下游产品的国际竞争力途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米(水分含量14%) 黄龙食品工业有限公司；酸性蛋白酶 宁夏和氏璧生物技术有限公司。

考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、乳酸、乳酸钠、氢氧化钠、盐酸、DNS等均为分析纯(AR)。

1.2 仪器与设备

AUY220分析天平 菲律宾Shimadzu公司；Z-36HK高速低温离心机 德国HermLe公司；UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；FE20 pH测定仪 梅特勒-托利多仪器有限公司；JYL-610粉碎机 山东九阳小家电有限公司；半微量凯式定氮仪 上海博迅实业有限公司；HH-8数显电子恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米淀粉加工工艺流程

原料玉米→清理、除杂→第1步浸泡→粗粉碎→分离胚芽和种皮→加酶第2步浸泡→细磨→多次水洗，离心→蛋白质分离→淀粉→洗涤→离心脱水→干燥→商品淀粉

1.3.2 第1步浸泡时间和浸泡温度的确定

分别称取整粒玉米100g，按照玉米与水1:2的比例，置于温度48、50、52、54℃的清水中，并分别于以上温度浸泡2、3、4、5h后，测定玉米籽粒、玉米胚芽含水量以及浸泡液中干物质含量。试验重复3次，取平均值。

1.3.3 第2步加酶浸泡试验条件确定

1.3.3.1 加酶量确定

把去除胚芽和种皮的粗磨后玉米与浸泡水按照1:2浸泡，调整浸泡液pH3.5、浸泡温度50℃，酸性蛋白酶加酶量分别为200、400、600、800、1000U/g进行浸泡，每1h取样，测定指标，浸泡时间为6h。玉米浸泡好后把浸泡液摇匀，取10mL 3000r/min离心5min，取上清液测量浸泡液中总糖含量，确定最佳酸性蛋白酶加酶量。试验重复3次，取平均值。

1.3.3.2 浸泡温度确定

酸性蛋白酶加酶量为600U/g，浸泡温度分别为46、48、50、52、54℃，其他条件同1.3.3.1节，确定最佳浸泡温度。

1.3.3.3 浸泡时间确定

酸性蛋白酶加酶量为600U/g，浸泡温度50℃，浸泡时间分别为1、2、3、4、5h进行浸泡，其他条件同1.3.3.1节，确定最佳浸泡时间。

1.3.4 指标测定

浸泡液中干物质含量、玉米颗粒和玉米胚芽含水量测定：均采用105℃烘箱连续烘干，直至质量恒定，称质量；淀粉中蛋白质含量测定：采用凯氏定氮法进行测量[1]；浸泡液中总糖含量测定：采用3,5-二硝基水杨酸法进行测量[14]。

1.3.5 玉米淀粉得率测定

把浸泡后的玉米连同浸泡液一起放入粉碎机中，以转速9500r/min进行3min粗粉碎，再以12000r/min进行3min细粉碎，用清水冲洗粉碎机，所得混合液过100目筛，多次水洗筛上物，所得筛下物淀粉乳混合液静止沉淀。去除上清液，剩余淀粉乳混合液多次水洗并离心脱水，得到的淀粉在通风条件下自然晾干称质量，测定淀粉得率。用凯氏定氮法测定淀粉中蛋白质含量。

1.3.6 响应面法优化试验设计

在第2步浸泡单因素试验基础上，根据B o xbenhnken试验设计原理，选取影响淀粉得率的浸泡温度、浸泡时间和酸性蛋白酶添加量3个主因素进行响应面优化组合，因素水平设计见表1。

表1 响应面分析因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 第1步浸泡时间和浸泡温度的确定

图1 不同浸泡温度和浸泡时间条件下玉米籽粒含水量(A)、玉米胚芽含水量(B)及浸泡液中干物质含量(C)Fig.1 Moisture contents of corn grains (A) and corn germ (B) and dry mass content (C) in steeping solution after different hours of the first steeping at different temperatures

由图1可以看出，随着浸泡时间的延长，不同温度下的玉米籽粒和玉米胚芽的含水量和浸泡液中干物质含量都在增加，此浸泡的目的是要找出能较容易去除玉米皮和胚芽的最佳条件，根据数据分析和在试验中的效果得出，浸泡液温度52℃、玉米浸泡时间3h时，玉米籽粒含水量30.93%，胚芽含水量46.16%，在此试验条件浸泡后的玉米较容易去除玉米皮和胚芽，去除胚芽保持完整。因此第1步浸泡工艺的最适条件确定为浸泡温度52℃、浸泡时间3h。

2.2 第2步浸泡工艺单因素试验

2.2.1 酸性蛋白酶添加量对淀粉得率的影响

图2 酸性蛋白酶添加量对淀粉得率的影响Fig.2 Effect of acid protease additon on corn starch yield

酸性蛋白酶能够进入玉米胚乳，分散玉米胚乳细胞中的蛋白质网，打破蛋白质网的二硫键，使淀粉颗粒能够从蛋白质网中最大程度的释放出来，破坏或消弱玉米粒各组成部分的联系，同时能促进玉米中不溶解蛋白质转变成溶解蛋白质，同时胚乳中的蛋白质失去自己的晶体结构，吸水膨胀变成凝胶体，增强了淀粉和蛋白质的分离，因而提高了淀粉得率[15]。由图2可知，当蛋白酶添加量达到600U/g左右时，淀粉得率最高，继续增加酸性蛋白酶的量，淀粉得率反而逐渐降低，这是由于酸性蛋白酶为复合酶，含有一定量的淀粉酶，当继续增加酸性蛋白酶的量，造成淀粉的水解，降低了淀粉得率。因此确定酸性蛋白酶的最佳添加量为600U/g。

2.2.2 浸泡时间对淀粉得率的影响

图3 浸泡时间对淀粉得率的影响Fig.3 Effect of steeping time on corn starch yield

浸泡时间过短，蛋白质网分散不完全，可溶性物质不能全部溶出，影响玉米淀粉的质量和得率；浸泡时间过长，细胞壁的纤维强度下降，有一部分细小纤维留在淀粉中很难分离[6]。由图3可知，随着浸泡时间的延长，淀粉得率逐渐升高，当达到2 h左右时，淀粉得率最高为63.8%，继续延长浸泡时间，淀粉得率开始逐渐降低，这是因为随着浸泡时间的延长，蛋白酶中的淀粉酶对淀粉的水解造成淀粉得率下降。因此最佳浸泡时间确定为2h。

2.2.3 浸泡温度对淀粉得率的影响

图4 浸泡温度对淀粉得率的影响Fig.4 Effect of steeping temperature on corn starch yield

浸泡温度是影响玉米浸泡的重要因素之一，低温时酸性蛋白酶的活性受到抑制使淀粉得率降低，高温时又会造成酸性蛋白酶的变性失活。由图4可知，最佳浸泡温度为50℃。

2.3 响应面试验对工艺参数的优化

2.3.1 响应面设计试验

综合以上单因素试验，选择浸泡温度X1、浸泡时间X2和酸性蛋白酶添加量X3对淀粉得率影响显著的因素，通过三因素三水平的响应面分析方法，确定淀粉最佳提取工艺，试验设计与结果见表2，其中1～12是析因试验，13～17是中心试验，用来估计试验误差。

表2 工艺参数优化响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 方差分析

通过Design-Expert 7.0软件的Box-Behnken程序对试验结果进行响应面分析，经二次回归拟合后，得出回归模型参数估计值、方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variances for the established regression model

用响应面软件分析结果得到以淀粉得率为目标函数的二次回归方程：

Y＝64.48＋1.30X1＋1.66X2＋1.19X3-0.58X1X2-0.22X1X3-0.50X2X3-1.74X12-2.62X22-1.91X32

方程中各项系数的绝对值直接反映了各因素对淀粉得率的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。从表3可知，用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，此模型P＜0.01，表明响应回归方程达到了极显著水平，相关系数R2＝0.9765，表明97.65%的数据可以用此方程来解释，因而该模型拟合程度良好。试验误差小，适合对玉米淀粉得率进行分析和预测。从模型的失拟性方差分析可以看出，失拟项不显著(P＞0.05)，表明该模型稳定，能很好的预测各因素对玉米淀粉得率的变化，使用该方程模拟真实的3因素3水平分析可行。

各因素影响程度从大到小的依次排列为浸泡时间、浸泡温度和酸性蛋白酶添加量。浸泡时间的影响最大(0.0001)，其次为浸泡温度(0.0006)和酸性蛋白酶添加量(0.0010)，均达到极显著水平。浸泡温度、浸泡时间和酸性蛋白酶添加量二次项对淀粉得率影响显著，P值分别为0.0007、0.0001、0.0004，其余各项P值均大于0.05，影响均不显著。

2.3.3 玉米淀粉得率的响应面图分析

图5 各因素对淀粉得率影响的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three factors on corn starch yield

从图5可知，浸泡温度、浸泡时间和酸性蛋白酶添加量对淀粉得率的影响显著，曲面较陡。随浸泡温度、浸泡时间和酸性蛋白酶添加量的增加响应值先增大后减小。由浸泡温度、浸泡时间和酸性蛋白酶添加量两两交互作用的等高线可知，沿浸泡温度轴向等高线密集，沿浸泡时间轴向等高线密集，沿酸性蛋白酶添加量轴向等高线密集，说明两因素的交互作用较强，影响显著。

2.3.4 回归方程及验证实验

对回归方程取一阶偏导数等于0，整理可得如下方程：

由式(1)～(3)联立解方程组。解得X1＝0.31、X2＝0.26、X3＝0.2581，即浸泡温度51.25℃、浸泡时间2.26h、酸性蛋白酶添加量703.22U/g，理论预测玉米淀粉得率为65.0523%。

采用优化条件进行验证实验，为了方便实验进行将试验条件修改为浸泡温度51℃、浸泡时间2.25h、酸性蛋白酶添加量700U/g。实验重复3次取平均值，结果见表4。表4中平均值与回归方程最优解较接近，说明得到的二次回归方程与实际情况拟合较好。

表4 验证实验结果表Table 4 Validation results of optimal corn steeping conditions

2.3.5 浸泡液中总糖含量与浸泡时间的关系图

图6 浸泡液中总糖含量与浸泡时间的关系Fig.6 Relationship between total sugar content in steeping solution and steeping time

由图6可知，采用优化后的条件进行试验，浸泡液中总糖含量随浸泡时间的延长而增加，总糖含量包括玉米籽粒中本身含有的糖类，其他是由淀粉水解产生。总糖含量的变化可以间接反映出淀粉含量的高低，因此在试验中要密切关注总糖含量的变化。

3 结 论

3.1 通过试验得出第1步浸泡工艺最适条件：浸泡温度52℃、浸泡时间3h。

3.2 通过单因素试验考察浸泡温度、浸泡时间和酸性蛋白酶添加量对淀粉得率的影响，应用响应面法分析，建立第2步浸泡工艺提取玉米淀粉的数学模型。响应面试验分析结果表明，第2步浸泡工艺条件为浸泡温度51.25℃、浸泡时间2.26h、酸性蛋白酶添加量703.22U/g，理论预测玉米淀粉得率65.05%，回归方程的决定系数为0.9765，回归方程显著，拟合良好，可进行实际预测。

由优化后得到的工艺条件：浸泡温度51℃、浸泡时间2.25h、酸性蛋白酶添加量700U/g进行验证实验得到的玉米淀粉得率为64.9%，玉米淀粉中蛋白质含量为0.42%。

浸泡液中总糖含量随浸泡温度的上升而增加，随着浸泡时间的延长而增加，随着酸性蛋白酶添加量的增多而增加，总糖含量包括玉米籽粒中本身含有的糖类，其余为淀粉水解产生，因此在试验中要密切主要总糖含量的高低。

3.3 在此浸泡工艺最佳条件下得到的淀粉得率比工业化中生产中的淀粉得率偏低，主要原因如下：在工厂生产中一些必要的分离步骤很难在实验室条件下模拟，这会对工艺研究的准确性产生影响，进而影响淀粉的得率；由于酸性蛋白酶为复合酶，含有一定的淀粉酶，会造成淀粉水解，降低了淀粉得率。

[1] 高嘉安. 淀粉与淀粉制品工艺学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001: 55-59.

[2] 田静, 董温. 在实际生产中影响玉米淀粉收率的几个因素[J]. 淀粉与淀粉糖, 2001(1): 40-43.

[3] PEREZ O E, HAROS M, SUAREZ C, et al. Effect of steeping time on the starch properties from ground whole corn[J]. Journal of Food Engineering, 2003, 60(3): 281-287.

[4] ECKHOFF S R, JAYASENA W V, SPILLMAN C K. Wet milling of maize grits[J]. Cereal Chemistry, 1993, 70(3): 257-259.

[5] CARANSA A, SIMELL M, LEHMUSSAARI A, et al. A novel enzyme application for corn wet milling[J]. Starch, 1988, 40(11): 409-411.

[6] JOHNSTON D B, SINGH V S. Use of proteases to reduce steep time and SO2requirements in a corn wet-milling process[J]. Cereal Chemistry, 2001, 78(4): 405-411.

[7] PEREZ O E, HAROS M, SUAREZ C. Corn steeping: influence of time and lactic acid on isolation and thermal properties of starch[J]. Journal of Food Engineering, 2001, 48(3): 251-256.

[8] JOHNSTON D B, SINGH V. Enzymatic milling of corn: Optimisation of soaking, grinding and enzyme incubation steps[J]. Journal of Food Engineering, 2004, 81(5): 626-632.

[9] MEZO-VILLANUEVA M, SERNA-SALDIVAR S O. Effect of protease addition on starch recovery from steeped sorghum and maize[J]. Starch, 2004, 56(8): 371-378.

[10] TESTERAR F, YOUSUFA R, KARKALAS J, et al. Properties of protease-treated maize starches[J]. Food Chemistry, 2008, 109(2): 257-263.

[11] HAROS M, TOLABA M P, SUAREZ C. Influence of corn drying on its quality for the wet-milling process[J]. Journal of Food Engineering, 2003, 60(2): 177-184.

[12] 赵寿经, 黄丽, 钱延春, 等. 嗜热乳酸菌的筛选及其在玉米淀粉湿法生产浸泡工艺中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2008, 3(1): 46-49.

[13] 闵伟红, 冯琦. 加压和复合酶法联合浸泡对玉米浸泡效果影响的研究[D]. 长春: 吉林农业大学, 2009.

[14] 陈钧辉, 陶力, 朱婉华, 等. 生物化学实验[M]. 3版. 北京: 科学出版社, 2003: 15-16.

[15] 任海松, 董海洲, 侯汉学. 玉米湿磨生产中减少浸泡时间的研究进展[J]. 中国食物与营养, 2007(5): 36-38.

Optimization of Two-step Corn Steeping by Response Surface Methodology

LI Suo-xia，MIN Wei-hong*，LI Hong-mei，LIU Jia，ZHANG Dan，LIU Jing-sheng
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

A two-step steeping process was designed to extract corn starch in the present work. A series of one-factor-at-atime experiments were done to investigate the effects of steeping time and temperature and acid protease dosage in the second steeping on starch yield. Further, the relationship of starch yield versus the three parameters was modeled based on a Box-Benhnken experimental design and analyzed by response surface methodology. The optimal corn steeping process conditions were identified as steeping at 52 ℃ for 3 h and then steeping at 51 ℃ for 2.25 h in the presence of 700 U/g acid protease. Under the optimal conditions, the predicted starch yield was 65.05%, in good agreement with the experimental value of 64.9%.

corn starch；steeping；response surface methodology

TS235.1

：A

1002-6630(2011)20-0007-06

2011-03-10

吉林省科技厅重点资助项目(20080250)

李锁霞(1983—)，男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。E-mail：lisuoxia521@yeah.net

*通信作者：闵伟红(1971—)，女，教授，博士，研究方向为发酵工程、粮油科学与深加工技术。E-mail：minwh2000@163.com