响应面法优化微波辅助提取龙须菜多糖工艺及其抗氧化活性研究

杨 华，庄陈丰

(1.浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 3 15100；2.宁波市农产品加工技术重点实验室，浙江 宁波 315100)

响应面法优化微波辅助提取龙须菜多糖工艺及其抗氧化活性研究

杨 华1,2，庄陈丰1

(1.浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 3 15100；2.宁波市农产品加工技术重点实验室，浙江 宁波 315100)

研究优化龙须菜多糖的提取工艺条件及其抗氧化活性，并对龙须菜微波辅助提取工艺进行响应面法优化。结果表明微波提取的最佳条件为功率495W、提取时间17min、液料比100:1，在此条件下龙须菜多糖提取率为33.11%。抗氧化实验显示龙须菜能有效清除DPPH自由基。

龙须菜；响应面法；多糖；微波辅助提取；抗氧化

龙须菜(Gracilaria lamaneiformis)又名海发菜，属于红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科，在我国沿海地区，如广东、福建、台湾等都有大量种植。据报道，龙须菜本身能吸收无机氮和无机磷，因此能通过吸附海水中的氮、磷和二氧化碳，从而达到缓解赤潮，降低海水富营养化的作用[1-2]。除了有净化水域的功用，它也是一种重要的经济海藻，可作为沿海鲍鱼养殖的优质饲料，同时也是可供人类食用的天然海洋蔬菜，因为它不仅含高膳食纤维、高蛋白，而且脂肪含量少，富含矿物质和维生素。早在明代，李时珍就在《本草纲目》中就提到过龙须菜具有软坚化痰、清热利水的功效。因此，具有药用、食用和经济性的龙须菜，就成为了继海带、紫菜和裙带菜之后，我国第4种人工栽培海藻。龙须菜多糖等众多海藻多糖，都是一类高活性物质。龙须菜多糖的功能包括：抑制肿瘤，可减少癌细胞的扩散；调节免疫活性，提高人体抵抗力；帮助降低血脂，预防高血压等心脑血管疾病；抗凝血、抗菌、抗病毒等多种生理活性和药理活性[3-4]。

目前，龙须菜多糖的提取主要有热水浸提、冷水浸提、酶解法浸提、微波和超声辅助提取等[5]，但是由于龙须菜藻体较硬，进行多糖提取前先要对其进行机械方法破坏其细胞壁，这样就大大提高了多糖的溶出率，然后再采取合适的方法提取多糖。本实验利用响应面软件对龙须菜多糖微波提取条件进行优化，并对提取出的多糖进行抗氧化性研究，以期为龙须菜多糖的产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

龙须菜购于温州洞头县。

浓硫酸、蒽酮、葡萄糖、乙醇、T CA和D P P H宁波奥博试剂有限公司。

RE-2000旋转蒸发仪、WFZ UV-2000分光光度计、移液器、中型机械WP750微波炉、高速离心机等。

1.2 方法

1.2.1 龙须菜粗多糖的提取

采用微波辅助提取龙须菜多糖：选取料水比1:40～1:130(g/mL)、提取功率128～872W、微波提取时间4～36min进行单因素试验，由单因素结果确定响应面试验的分析因素和水平，采用响应面法得到最佳的微波提取的方案，每组试验加入5g龙须菜粉末作为提取原料，利用微波对龙须菜进行提取前，先在90℃热水中萃取2 h，再进行微波提取。

1.2.2 多糖总含量测定

采用蒽酮-硫酸比色法[2-3]，根据蒽酮-硫酸比色法测得葡萄糖质量浓度与620nm处吸光度的关系，绘制标准曲线图，得出标准曲线回归方程为A＝0.009C，R2＝0.9901。将所测得的吸光度代入标准曲线方程，计算样品溶液中的多糖质量浓度(C)/(mg/L)。

1.2.3 多糖抗氧化性的测定

DPPH法[6-7]：取3只10mL试管，向1号管内准确移取2mL的给出浓度多糖溶液，再向其中加入2mL的DPPH使用液，室温避光静置30min后在517nm处测定其吸光度(Ai)。向2号管准确移取2mL多糖溶液，再向其中加入2mL 50%乙醇，室温避光静置30min后在517nm处测定其吸光度(Aj)。向3号管准确移取2mL DPPH使用液后加入2mL的蒸馏水，室温避光静置30min后在517nm处测定其吸光度(Ac)。试验以50%乙醇溶液作为参比溶液，且每种样品均做3个平行试验。

1.2.4 数据处理

采用Design Expert 7.0 软件和EXCEL进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对龙须菜多糖提取率的影响

在固定提取时间20min、液料比(mL/g)70:1的条件下，不同微波功率对多糖得率的影响如图1所示。

图1 微波功率对龙须菜多糖提取率的影响Fig.1 Effect of microwave power on polysaccharide yield

由图1可得，不同微波功率对龙须菜多糖提取率的影响很显著，随着微波功率的不断增大，多糖提取率也随之升高，当微波功率达到500W时，多糖提取率达到最高点，提取率为30.2%。当微波功率达到872W时，多糖的提取率明显下降，这可能是多糖被微波分解所致，原因有待进一步研究。

2.1.2 提取时间对龙须菜多糖提取率的影响

提取时间延长能够提高多糖得率。在固定微波功率500W、液料比70:1条件下，不同提取时间对多糖得率的影响如图2所示。

图2 提取时间对龙须菜多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction duration on polysaccharide yield

由图2可知，随着提取时间的增加，龙须菜多糖的提取率也随之升高，在4～12min，提取率的变化比较明显，而当微波时间达到20min时，多糖提取率迅速增加，达到最大值，提取率为29.3%。而当微波时间达到24min时，多糖的提取率显著下降。多糖提取率的下降可能由于微波时间过长，多糖和杂质相结合离心除去而造成损失或是微波对多糖有分解的作用。

2.1.3 液料比对龙须菜多糖提取率的影响

在固定微波功率500W、提取时间20min条件下，不同提取液料比对多糖得率的影响如图3所示。

图3 液料比对龙须菜多糖提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on polysaccharide yield

由图3可得，随着液料比的增大，多糖得率逐渐增大，当液料比在40～70mL/g时，多糖得率上升很快；当液料比大于70:1时，增长趋势趋于缓慢。这是因为对于一定量的龙须菜粉末，溶剂用量的增加可以增加固液接触面积和质量浓度差，有利于扩散速度的提高。当料液比继续增大，固液质量浓度差的增幅逐渐降低，多糖得率的增加也趋于平缓，过多使用提取溶液会造成后续处理的难度和提高成本，所以最优选择是液料比70:1。

2.2 响应面法对微波提取龙须菜多糖工艺的优化

表1 微波提取龙须菜多糖响应面试验设计及结果Table 1 Experimental design and corresponding results for response surface analysis for optimizing microwave-assisted extraction of polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis

根据单因素试验确定自变量，分别为功率、微波提取时间、液料比，以龙须菜多糖提取率为响应值，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理进行响应面试验，具体见表1。

利用Design Expert 7.0 软件对设计表进行多元回归拟合，得出龙须菜多糖提取率(Y)对功率(A)、微波提取时间(B)、液料比(C)的二次多项回归模型方程为：Y＝22.00＋6.78A＋1.15B＋3.63C＋0.82AB＋2.97AC＋0.37BC-0.52A2-1.86B2-2.26C2。

回归方程中各变量对响应面值影响的显著性由F检验来判断，P值越小，则响应变量的显著程度越高。从表2可知，在所有试验因素中，功率对多糖的提取率高低起到至关重要的作用。由表2数据可看出，试验因素和响应值之间不是简单的线性关系，二次项和交互项都和响应值有联系，由此说明，响应面软件生成的方程具有充分的拟合性，回归方程的显著性也越高，另相关系数R2为0.9931。R2＝0.8898与R2Adj＝0.9843相差不大，也证明了回归方程可以很好的表述各自变量与响应面值之间的确切关系，说明该回归方程能够确定最佳的多糖提取工艺。

表2 微波辅助提取龙须菜多糖的响应面试验方差分析表Table 2 Variance analysis of the established regression model for polysaccharide yield

从表2可知，上述回归方程描述各试验因素与响应面值之间的关系时，其因变量与全部自变量的线性关系显著，模型的显著水平远远低于0.05，r＝模型/总量＝562.69/566.59＝0.9931，此时得出的回归方程模型高度显著，该试验方法可靠。当显著水平小于0.05时，它所对应的条件对响应值的作用越明显，方程失拟误差越不明显，可用响应面得出的回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。从表2的数据结果可以看出，作用明显的是A、B、C、A C、B2、C2，对龙须菜多糖提取率影响大小依次为功率、液料比、微波提取时间，即功率对龙须菜多糖提取率的影响最为显著。

图4 各两因素对龙须菜多糖提取率交互影响的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of microwave power, extraction duration and liquid-to-material ratio on polysaccharide yield

根据上述的回归分析结果，在响应面软件中生成相应的响应曲面图及其等高线图，以确认功率、液料比、微波提取时间3因素对多糖提取率的影响。图4直观地反映了各试验因素对响应值的影响。图4响应面曲线的最高点和等高线上存在所谓的极限值，反映在响应面曲面图和等高线上，就是曲面最高点同时也是等值线中面积最小的椭圆中心点。对三组图进行分析后得知，功率(A)对龙须菜多糖提取率的影响最为明显，表现为曲线倾斜率大；而液料比(C)和微波提取时间(B)的曲线表现的相对平缓，说明B、C对响应值的影响较小。

2.3 最佳工艺条件的预测和验证

根据响应面软件得出的试验模型，预测出理论条件下的最优工艺条件为功率494.68W、液料比99.87:1、微波提取时间16.39min，相应的龙须菜多糖提取率为33.05%。为实际操作的便利，将最优值修正为提取温度495W、液料比100:1、提取时间17min。实际测得的多糖平均得率为33.11%，与理论值的误差约为0.06%。因此，基于响应面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

2.4 不同提取工艺条件下龙须菜多糖抗氧化性能研究

选取微波提取的多糖进行抗氧化性能研究，试验数据见表1。从表1可知，14、16、17组所对应的清除率明显比其他组数高，都达到了50%以上的清除率，而6、7、8、9、10、11、13、15组多糖对DPPH自由基的清除率在30%～50%，最差的组数，其多糖对DPPH自由基的清除率也在20%左右。对数据进行比较分析后得出，清除率高的组数，其对应的多糖提取条件为，在微波功率314～500W、提取时间12～20min、液料比70:1～100:1条件下，多糖提取率都在23%以上。对上述结果进行分析后得出，随着多糖浓度的增加，其相应的DPPH自由基清除率也增高，说明了龙须菜多糖具有较好的抗氧化活性。

3 结 论

采用响应面软件优化龙须菜多糖的提取工艺后，得出以下微波提取法最佳工艺为提取温度495W、液料比100:1、提取时间17min，多糖提取率为33.11%。并得到龙须菜多糖得率与微波处理各因素变量的二次方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定应用价值。对微波提取的多糖的抗氧化性研究结果表明，对DPPH自由基有一定的清除效果。

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Gracilaria lamaneiformis Polysaccharides: Optimization of Microwave-assisted Extraction by Response Surface Methodology and Antioxidant Properties

YANG Hua1,2，ZHUANG Chen-feng1
(1. Faculty of Biological and Environmental Science, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China；2. Ningbo Key Laboratory of Agricultural Products Processing Technology, Ningbo 315100, China)

In this study, the microwave-assisted extraction of polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis was optimized by response surface methodology (RSM) and the antioxidant properties of extracted polysaccharides were studied. The results showed that the optimum conditions for polysaccharide extraction were microwave power of 495 W, extraction duration of 17 min, and water-to-material ratio of 100:1. Under the optimum conditions, the extraction yield of polysaccharides was 33.05%. Antioxidant analysis showed that polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis could effectively remove DPPH free radicals.

Gracilaria lamaneiformis；response surface methodology (RSM)；polysaccharide；microwave-assisted extraction；antioxidant properties

TS254.58；Q539

：A

1002-6630(2011)20-0079-04

2011-05-22

宁波市渔业局科技专项(甬海200769)

杨华(1978—)，男，讲师，硕士，研究方向为水产品加工及贮藏。E-mail：yanghua@zwu.edu.cn