我国日本血吸虫核酸疫苗的研究进展

蒋 斌 魏 骏

(巢湖职业技术学院 安徽巢湖 238000;①巢湖市坝镇卫生院)

血吸虫病(schistosomiasis)是呈世界性分布的严重危害人类及家畜的寄生虫病，发病率仅次于疟疾(malaria)。全世界至少有2亿血吸虫病感染者。该疾病流行区仍有6亿人受其威胁[1]，我国是受日本血吸虫病危害最为严重的国家之一，流行株为日本血吸虫中国大陆株(Chinese Mainland Strain)，全国血吸虫病流行县(市、区)454个;累计达到血吸虫病传播消灭标准的县(市、区)265个，2009年度，我国实有患者36.6万人[2]。本文概述了防治日本血吸虫病的核酸疫苗的免疫机制、特点及我国日本血吸虫核酸疫苗候选分子的研究进展。

1 核酸疫苗的免疫机制及特点

1990年Wolff等[2]人将DNA重组表达载体注入小鼠的骨骼肌中，结果意外发现载体上的基因在局部肌细胞内表达，且产生了抗体，这一偶然发现导致核酸疫苗的诞生。由于大多利用质粒DNA载体进行核酸疫苗研究，因而核酸疫苗又称为DNA疫苗。

1.1 核酸疫苗的免疫机制 免疫机制主要有以下3点:①核酸疫苗接种后，被结合在游离核糖体上的mRNA翻译而表达合成的内源性抗原蛋白，其中一部分以有效的比例结合到泛肽上，呈递给蛋白酶，降解为多肽，通过抗原肽转运结构(TAP)运送到内质网腔，与MHC－Ⅰ类分子形成聚合体，抗原多肽－MHC－Ⅰ类分子聚合体通过内质网进入高尔基体，最终到达细胞膜的表面，诱发CD8+细胞毒性T细胞应答的产生。②另一部分蛋白抗原从分泌它们的抗原递呈细胞(APC)的细胞膜上进入MHC－Ⅱ类型途径，进入MHC－Ⅱ类呈递途径的蛋白在溶酶体中水解，产生大约20～25个氨基酸的多肽，这些溶酶体和包含MHC－Ⅱ分子的囊泡融合，MHC－Ⅱ分子结合合适的多肽形成MHC异聚体，成熟的MHC异聚体在细胞膜表面刺激CD4+T细胞，引发体液免疫应答。③一部分抗原多肽递呈给B细胞，使B细胞自身活化，产生特异性抗体，诱发体液免疫。另外，递呈后的CD4+辅助性T细胞(Th)活化、增殖可产生多种细胞因子，进一步促进和强化体液免疫和细胞免疫。胞内型的蛋白分子在与MHC－Ⅰ类分子结合后，是诱导细胞免疫的最好抗原形式。

1.2 核酸疫苗的特点 与传统疫苗相比，核酸疫苗有以下优点:①可以模拟减毒活疫苗产生全身性保护性免疫反应，而不需使用复制型载体或活的微生物就可产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，在宿主细胞内合成的蛋白质经历了加工、修饰，然后递呈给宿主免疫系统等与自然感染相似的过程，更接近天然分子形式包含构型相关位点，因而能诱导更有效的免疫应答。②生产简便、成本低廉、稳定性好且贮存方便。质粒DNA可以制成干粉样制剂型，在常温下稳定，便于储存和运输。③可诱导出全方位免疫，包括细胞免疫和体液免疫。核酸疫苗免疫后，可检测出较高滴度的特异性抗体和CTL反应。④使用安全，没有感染病原体的危险，利用质粒作载体，不涉及感染性因子。⑤同种异株的交叉保护作用。采用同种不同株之间的保守DNA序列作核酸疫苗，可以使其免疫作用突破地理株的限制，同种异株间有交叉免疫保护作用。⑥将不同病原体的DNA序列克隆到同一质粒载体输入机体联合免疫，可产生对两种病原体的共同保护作用。⑦不仅有良好的预防作用，而且对现症患者有一定的治疗作用。

2 我国候选血吸虫核酸疫苗的研究

2.1 副肌球蛋白(Sj97)97kDa的副肌球蛋白是大多数无脊椎动物(包括血吸虫)肌肉组织内的一种结构蛋白，分子量为97kDa。Yang等首先报道了用编码日本血吸虫97kDa分子的基因片段cDNA与真核细胞表达载体pRSV－BL构建裸露DNA，即PMY6，然后直接注射小鼠股四头肌，产生了识别日本血吸虫97kDa蛋白的抗体。陈家旭等[3]报道将40只C57BL/6小鼠随机分成疫苗组、空质粒组、感染对照组和空白对照组攻击感染后7周，剖杀小鼠检测肝脏虫卵肉芽肿直径Sj97DNA疫苗组(183.75±42.36)μm，显著小于空质粒组的(303.12 ±37.36)μm 和感染对照组的(304.38±53.23)μm，表明Sj97DNA具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用。

2.2 谷光甘肽－S－转移酶(GST)GST是以谷胱甘肽为共同底物的一组具有解毒功能的同工酶，被公认为具有很大潜在价值的疫苗分子。日本血吸虫至少有两种26kDa和28kDa的同工酶(Sj26、Sj28)。血吸虫的GST含量丰富，有助于其在宿主体内寄生。Shi Fuhui等以Sj28 GST肌注免疫绵羊，先以200条尾蚴攻击感染，得到65.0%的减虫率和70.5%肝组织减卵率。但第二次实验以300条尾蚴攻击感染，获得30.4%减虫率和43.1%肝组织减卵率，效果不显著。Sj28GST核酸疫苗对黄牛进行田间免疫试验，取得明显的免疫保护效果，减虫率43.6%，粪便减卵率76.9%。提示用此疫苗对黄牛进行大规模免疫预防，可减少人群感染的机会。杨平等[4]用构建的pIRES－Sj26疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠，检测血清总IgG抗体浓度、INF－γ的含量明显高于空白对照组和空载体组;其脾脏大小指数(脾SI)高于空白对照组和空载体组;CD8+细胞百分比高于空白对照组和空载体组，表明pIRES－Sj26疫苗能增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。

2.3 23 kDa膜蛋白(Sj23)Sj23的结构区与一组哺乳动物膜蛋白(如淋巴细胞表达蛋白CD37、CD53和TAPA－1等)的表面标志CD53同源，这组膜蛋白的主要功能与细胞增殖有关。因此Sj23在细胞增殖和血吸虫生长中起着重要作用。李柳哲等将日本血吸虫真核表达载体pBK－Sj23，pBK－Sj26以及pCDSj23，pCD－Sj26，分别接种小鼠股四头肌，结果发现疫苗pCDSj23和pCD－Sj26诱导小鼠的减虫率和减卵率分别为30.5%和33.0%，疫苗pBK－Sj23和pBK－Sj26诱导小鼠的减虫率和减卵率分别为18.2%和21.7%，含血吸虫同一抗原分子的不同载体诱导小鼠的抗攻击感染能力具有显著性差异。柳建发等[5]用编码Sj23－pcDNA质粒免疫的小鼠产生了针对Sj23的特异性IgG，而pcDNA对照组免疫小鼠血清则无此作用，也证明Sj23－pcDNA疫苗对日本血吸虫攻击感染有一定的保护力。

2.4 天冬酰胺肽链内切酶(Sj32) 国内学者对Sj32核酸疫苗进行了深入的研究，并取得了一些可喜成绩。谢来平等分别以100μg/100μL的pCD－Sj32经股四头肌注射免疫 BALB/c小鼠，结果各免疫组与对照组相比均产生较好的保护免疫效果，减成虫率为35.6%～44.44%，肝组织减卵率为39.6%～69.1%。Wei F等[6]将pVAX/Sj26GST和pVAX/Sj26GST+ILl8共同免疫小鼠，减虫率分别为30.1%和49.4%，相应的肝脏和粪便的减卵率分别为44.8%、53.0%和50.6%、56.6%。

2.5 磷酸丙糖异构酶(TPI)TPI为二聚体糖酵解酶，它是一种优势蛋白，分布于各种生物的所有组织中，也是一种重要的抗血吸虫病疫苗候选分子。鲁飞等[7]利用磷酸丙糖异构酶基因(TPI基因)密码子优化后的DNA疫苗分A(pcDNA3.1空质粒对照组)、B(pcDNA3.1－TPI组)、C(pcDNA3.1 －TPI－mHSP70组)、D(pcDNA3.1－TPLopt组)、E(pcDNA3.1－TPLopt－ mHSP70组)等5组免疫BALB/C小鼠，B、C、D、E组小鼠血清均检测到特异性IgG及IgG2a与IgG1抗体，IgG2a/IgG1的比值分别为1.73、2.06、2.44、3.09。D、E 组的 IL －2、IFN－γ、TNF 含量较B、C组均有不同程度地升高。D、E组减虫率分别为36.03%、39.03%，减卵率分别为41.71%、46.85%，均显著高于 B、C 组(P＜0.01)，表明TPI基因密码子优化后的DNA疫苗相对于未优化TPI DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用，且诱导宿主产生较强的以Th1为主的免疫应答。

2.6 脂肪酸结合蛋白(FABP) 脂肪酸结合蛋白是血吸虫脂代谢过程中的必需载体，对血吸虫在脊椎动物宿主体内的发育起决定作用。FABP分子既可作为疫苗候选分子又可作为药物靶。其全基因序列为578bp(mRNA)，内含一个399bp的编码区。余传信等构建的重组真核表达质粒SjFABP－pcDNA3.1，通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠，显示该核酸疫苗有一定的抗血吸虫感染的保护性作用。朱晓华等[8]成功构建和表达重组质粒pVIV02－Sj14FABP，免疫BALB/c小鼠，分别获得24.1%的减虫率和27.2%的减卵率，表明该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。

2.7 粘蛋白样蛋白(MLP) 血吸虫的MLP属于性发育调节蛋白的一种，其基因是目前所知的唯一不在卵黄腺表达的血吸虫雌虫特异性序列。刘彦等[9]将日本血吸虫 pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗对家兔免疫作用，结果可明显抑制家兔肝脏虫卵肉芽肿的大小，肉芽肿数量减少，肝组织减卵率为28.1%，并可诱导IgA、IgG1变化，诱生INF－γ应答，表明该疫苗对日本血吸虫尾蚴攻击感染可产生一定的保护作用。

2.8 日本血吸虫信号蛋白14－3－3(Sj14－3－3) 刘庆中等[10]将Sj14－3－3DNA免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验，6周后，剖杀小鼠减虫率与减卵率分别为34.2%和50.7%，表明重组Sj14－3－3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能，有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗。李德发等将765bp的Sj14－3－3编码基因插入pBK－CMV，构建pBK－Sj14－3－3。将100g重组质粒肌肉注射免疫BALB/c鼠，3周后加强1次，末次免疫后5天用40条Sj尾蚴进行攻击，攻击后6周发现免疫鼠的减虫率和肝组织的减卵率分别为27%和79%，鼠肝肉芽肿直径减少29%，表明pBK－Sjl4－3－3也可诱导小鼠产生一定的保护力。

2.9 SjCWL01 该基因全长636bp，开放阅读框(ORF)分析含有一个462bp大小的完整阅读框，其起始密码子为ATG，位于第68～70个核苷酸，终止密码子TAG，位于第527～529位核苷酸，3＇端有较长的PolyA尾。基因编码153个氨基酸，理论分子量为17.5kDa。彭先楚等[11]构建了日本血吸虫 pcDNA3/SjCWL01 核酸疫苗免疫小鼠结果显示，重组DNA疫苗与对照组比较，虫荷、每克肝卵、每克粪卵数分别下降了27.6%、39.5%、45.9%，表明该疫苗具有诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。

2.10 混合或多价疫苗 血吸虫病各种核酸疫苗作为单一成分在动物免疫保护试验中都不同程度地取得了成功，而血吸虫是一种多细胞生物，生活史复杂，在长期与宿主共进化的过程中产生了多种免疫逃避机制。目前混和(或)多价核酸疫苗被广泛研究。

李春艳等[12]成功构建日本血吸虫多价DNA疫苗pVIVO2－SjFABP－23，免疫小鼠进行免疫保护性实验，获得52.1%减虫率和60.9%的减卵率，且均高于单价疫苗pVIVO2－Sj23。夏涛等[13]用二价DNA疫苗pVIVO2－SjFABP－SjGST在体内诱发的特异性抗体分别与pET30a－SjFABP及pET30a－SjGST原核表达的抗原蛋白产生特异性免疫反应。徐元宏等[14]在证明核酸疫苗pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3具有部分抗血吸虫感染的基础上，联合使用CpG和pcDNA3.1(+)－mIL－12免疫小鼠，实验结果 pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3+pcDNA3.1(+)－mIL－12和pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3+CpG免疫小鼠的减虫率分别为41.2%和28.7%;减卵率分别为52.6%和41.2%。说明核酸疫苗pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3抗血吸虫攻击感染作用在mIL－12和CpG等佐剂作用下得到增强。余光清等[15]将654bp的Sj26GST的cDNA片段克隆入pEGFP－N3，构建pEGFP－Sj26GST;将100μg的pEGFP－Sj26GST肌肉注射免疫BALB/c鼠，2周后加强1次，4周后用50μg的rSj26GST抗原皮下注射加强1次，末次免疫后2周后用40条Sj尾蚴进行攻击，在攻击6周后免疫鼠的减虫率和肝组织减卵率分别为50.8%和32.7%，说明pEGFP－Sj26GST质粒可诱导小鼠产生一定的保护力。魏峰等[16]分别以肌肉注射重组质粒pVAX－GST、pIRESneo－Sj23、pVAX－GST－FABP和pIRESneo－GST－FABP－Sj23均能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体，pIRESneo－GST－FABPSj23免疫组所诱导的IgG水平最高，减虫率分别为26.1%、30.8%、33.2%和47.5% ，减卵率分别为25.4% 、45.0%、48.4% 和69.8%。pIRESneo－GST－FABP－Sj23的减卵率和减虫率明显高于其他DNA疫苗。鲁燕妮等[17]利用从香菇中提取的多糖进行动物实验，证明植物多糖对日本血吸虫疫苗pVIVO2－Sj14－Sj23有较好的增效作用，并在此基础上初步探讨了植物多糖佐剂对血吸虫疫苗的增效机理。胡媛等[18]通过基因拼接法构建pVIVO2－Sj14－3－3－Sj23融合质粒。将pVIVO2－Sj14－3－3－Sj23和 pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23等量混合后，建成混合DNA疫苗。将100μg的 pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23、pVIV02－Sj14－3－3－Sj23和混合质粒肌肉注射分别免疫BALB/c鼠，4周后用40条Sj尾蚴进行攻击。攻击后6周发现pVIVO2－Sjl4－3－3/Sj23免疫鼠的减虫率和减卵率分别为41.20%和53.83%，pVIVO2－Sjl4－3－3－Sj23免疫鼠分别为53.26%和39.78%，混合质粒免疫鼠分别为58.97%和47.68%，所有免疫鼠的肝虫卵肉芽肿体积显著缩小，提示混合质粒的免疫效果类似于pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23或pVIVO2－Sjl4－3－3－Sj23融合质粒。门静涛等[19]将小鼠IL－18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体，构建真核表达质粒pVAX/mlL－18和pVAX/Sj23，联合或单独免疫小鼠，以pVAX1空载体作对照，检测结果表明，联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG，较高水平的IFN－γ和IL－2。攻虫试验表明，联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%，明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%)。以上试验结果表明，IL－18能明显增强Sj23DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答，并且产生较强的保护作用。

这些实验结果表明，一些抗原分子组成的多基因疫苗或混合佐剂诱导宿主的免疫力往往存在一定程度上的协同作用，从而提高宿主抗血吸虫感染的能力。

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