不同提取条件对草莓果实抗氧化物质和抗氧化活性的影响

罗 娅，王小蓉，张 勇，刘泽静，任云南，杨 涛，汤浩茹

(四川农业大学园艺学院，四川 雅安 625014)

不同提取条件对草莓果实抗氧化物质和抗氧化活性的影响

罗 娅，王小蓉，张 勇，刘泽静，任云南，杨 涛，汤浩茹*

(四川农业大学园艺学院，四川 雅安 625014)

以草莓栽培品种“丰香”(Fragaria ananassa)绿熟阶段的果实为试材，研究提取试剂、温度、时间对草莓果实抗氧化物质和抗氧化活性的影响。结果表明，甲醇-水-盐酸(体积比80∶19.9∶0.1)提取物中总酚、类黄酮、抗坏血酸，DPPH自由基清除能力和铁还原氧化能力显著高于甲醇、乙醇、甲醇-乙醇-丙酮体积比(1∶1∶1)和水的提取物。然而，抗氧化物质提取的最佳条件(60℃，480min)与获得最高抗氧化活性的提取条件(25℃，120min)并不一致，说明抗氧化物质含量的高低并不总是草莓果实提取物抗氧化活性强弱的指示剂。综合抗氧化物质的提取量以及提取物的抗氧化活性，甲醇-水-盐酸(体积比 80∶19.9∶0.1)在25℃进行120min草莓果实抗氧化物质的提取更为适合。

草莓；果实提取物；提取剂；抗氧化物质；抗氧化活性

氧化损伤被认为是导致人类癌症和心脏病等慢性疾病发生的主要原因之一[1]。大量研究表明，蔬菜和水果的食用有助于降低人类患慢性疾病的可能[2-3]，其根本原因在于蔬菜和水果中含有丰富的抗氧化物质[4-5]，从而能保护细胞抵御自由基的攻击，减轻氧化损伤。

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是一种美观、可口且富含抗坏血酸、多酚类物质、钾、纤维、单糖和其他次级代谢产物的水果[6-7]，其抗氧化能力是苹果、桃、梨、番茄、柑橘和猕猴桃等园艺产品的2～11倍[8-10]。在草莓成熟过程中，又以绿熟期(坐果后约7～20d)的草莓果实抗氧化能力最强[11-12]。然而在生产中为保证草莓品质，多余的绿熟期小果将被疏掉，从而产生大量农业废弃物。从环保观点来看，对农业和食品行业中植物废弃物的再次利用是目前发展的新趋势，若能对废弃的绿熟期草莓果实进行天然抗氧化物质的开发将在生产实践上发挥重要作用。

目前植物抗氧化物质的提取多采用溶剂抽提的方法，其根本原因在于方法简单和成本较低[13]。水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯以及有机溶剂与水的混合物是常用的提取试剂[14-17]。在提取过程中，提取时间、pH值、温度以及抗氧化物质的化学结构也影响着植物抗氧化物质的提取效率[18-19]，因此探寻较优的提取体系从而获得更高抗氧化活性的提取物是非常必要的。目前，草莓果实抗氧化方面的研究多集中在不同品种抗氧化能力大小和抗氧化物质的组成上[8-12]，有关草莓果实抗氧化物质的提取体系还未见报道。因此，本实验以绿熟期草莓果实为试材，探讨提取试剂、温度和时间等主要因素对其抗氧化物质和抗氧化活性的影响，从而获取草莓果实抗氧化物质较优的提取体系，以期为进一步开发利用废弃的草莓果实提供一定参考。

1 材料与方法

“丰香”(Fragaria ananassa)绿熟期的草莓果实。于2010年4月取自四川农业大学教学科研园区大棚内，采后立即运回实验室，选择大小一致，无病虫害，无损伤的果实为试材，用液氮速冻并研磨成粉后，贮于-80℃超低温冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 溶剂抽提

称取0.15g来自30个果实的混合样品分别溶于3mL的甲醇、乙醇、水、甲醇-乙醇-丙酮混合液(体积比1∶1∶1)以及甲醇-水-盐酸混合液(体积比80∶19.9∶0.1)中，充分振荡后分别放于25℃和60℃密闭的试管中水浴60、120、480min。水浴后10000×g高速冷冻离心10min，取上清液立即进行抗氧化活性与抗氧化物质含量的测定。

1.2.2 总酚的测定

总酚物质含量的测定按照Folin-Denis法[20]，取1mL提取液于Eppendorf管中，分别加入0.5mL福林酚，3mL 2% Na2CO3溶液，室温避光2h后，以抽提试剂为对照。用紫外分光光度计测定765nm波长处的吸光度，计算总酚含量，以mg/100g的没食子酸为标准物。

1.2.3 类黄酮的测定

参照王霄霄[21]的方法，略作修改。取0.1mL提取液于Eppendorf管中，先后加入0.3mL 8% NaNO2溶液，反应6min，0.3mL 10% Al(NO3)3溶液，反应6min，2.0mL 2mol/L NaOH溶液，4.9mL乙醇，混匀静置10min后，10000×g离心10min，收集上清液，以提取试剂为对照，用紫外分光光度计测定510nm波长处的吸光度，计算类黄酮含量，以mg/100g的芦丁为标准物。

1.2.4 抗坏血酸的测定

参照孙园园[22]的方法，略作修改。取0.3mL上清液，加入0.75mL含5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液(150mmol/L，pH7.4)和0.15mL 10mmol/L DTT。室温放置10min后，加入0.15mL 0.5% N-乙基马来酰亚胺以消除多余的DTT。然后加入0.6mL 10% 三氯乙酸，0.6mL 44%正磷酸溶液，0.6mL 4%双吡啶酒精(70%)溶液和0.15mL 0.3% FeCl3溶液。混匀后40℃水浴40min，测定525nm处的吸光度，计算抗坏血酸含量，以mg/100g的抗坏血酸为标准物。

1.2.5 FRAP(ferric reducing antioxidant power，铁还原氧化能力)法测定抗氧化能力

参照杨冬梅等[20]的方法，取20μL上清液，加入1.8mL TPTZ工作液(由0.3mol/L 醋酸盐缓冲液25mL，10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，20mmol/L FeCl3溶液2.5mL组成)，混匀后37℃反应30min，测定593nm波长处的吸光度。以1.0mmol/L FeSO4为标准，样品抗氧化活性(FRAP值)以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。

1.2.6 DPPH(1,1-diphebyl-2-picrylhydrazyl，1,1-二苯代苦基苯肼)自由基清除率的测定

参照杨冬梅等[20]的方法，略作修改。将2.8mL 60μmmol/L DPPH-乙醇溶液与20μL上清液混合，30min后测定反应液在517nm波长处的吸光度，对照以80%乙醇代替样品。DPPH自由基清除率计算公式：

1.2.7 数据分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据结果以“平均值±标准差”(n=3)表示，并进行显著性检验(P≤0.05)，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 绿熟期草莓果实提取物抗氧化物质含量

绿熟期草莓果实抗氧化物质的提取量随提取试剂、提取时间和温度有所差异，其中提取试剂的影响最大(表1)。在5种提取试剂中，甲醇-水-盐酸(体积比80∶19.9∶0.1)是草莓果实总酚最有效的提取试剂，其次是甲醇、甲醇-乙醇-丙酮(体积比1∶1∶1)、乙醇和水。5种提取试剂在60℃条件下总酚的提取量较25℃高，然而提取时间对总酚提取量的影响并没有表现出规律性的变化。从表1分析得出，甲醇-水-盐酸溶液(80∶19.9∶0.1)在60℃，480min的条件下，总酚提取量最多(1058mg/100g)，是相同条件下其他4种提取试剂的1.15～2.14倍。

表1 绿熟期草莓果实提取物抗氧化物质含量Table 1 Contents of total phenols, flavonoids and ascorbic acid in different solvent extracts from strawberry fruits

提取物中包括类黄酮在内的酚类物质和抗坏血酸等抗氧化物质。在25℃时，类黄酮在甲醇溶液中的提取效果最好，提取量在13.93～15.83mg/100g之间，其次是甲醇-水-盐酸(8.73～11.29mg/100g)，甲醇-乙醇-丙酮(6.35～11.96mg/100g)，乙醇(6.80～7.96mg/100g)和水(2.92～3.96mg/100g)。提取时间(60～480min)对类黄酮提取量的影响也无规律性的变化，除水在60min时获得较高含量的类黄酮提取物外，其余4种提取试剂均在120min时获得较高含量的类黄酮。在60℃时，草莓果实类黄酮的提取量几乎均高于在25℃时的提取量，除甲醇-乙醇-丙酮(1∶1∶1)外，其他4种提取试剂均在60℃，480min的条件下获得最高含量的类黄酮。在此条件下，又以甲醇-水-盐酸溶液(80∶19.9∶0.1)的提取效果最好(25.37mg/100g)，是其他4种提取试剂类黄酮提取量的1.35～2.79倍。

在抗坏血酸的提取过程中，仍然是甲醇-水-盐酸溶液(80∶19.9∶0.1)的提取效果最好。温度对抗坏血酸的提取效果影响较大，25℃比60℃更适合抗坏血酸的提取(表1)。在60℃、480min的条件下，甲醇-水-盐酸溶液(80∶19.9∶0.1)对抗坏血酸的提取量仅有13.68mg/100g，而在25℃，120min的条件下，甲醇-水-盐酸溶液(80∶19.9∶0.1)对抗坏血酸的提取量达到最大值31.15mg/100g。比较草莓果实提取物抗氧化物质的含量发现，提取物中总酚含量远远高于类黄酮与抗坏血酸的含量(表1)，认为总酚是草莓果实提取物中主要的抗氧化物质。

2.2 绿熟期草莓果实提取物抗氧化活性

DPPH和FRAP法是广泛用于测定果蔬抗氧化能力的两种方法。本实验采用这两种方法来探讨绿熟期草莓果实提取物的抗氧化活性，所有提取物均表现出抗氧化活性，并且两种方法的测定结果具有一致性(表2)。当提取条件在25℃，120min时，甲醇-水-盐酸(80∶19.9∶0.1)提取物表现出最强的DPPH自由基清除能力(71.25%)和铁还原氧化能力(0.36mmol/100g)，乙醇提取物的抗氧化能力最弱，DPPH自由基清除能力和铁还原氧化能力仅有甲醇-水-盐酸(80∶19.9∶0.1)提取物的28.53%和30.56%。甲醇-水-盐酸(80∶19.9∶0.1)提取物的抗氧化活性对温度非常敏感，当提取温度在60℃时，DPPH自由基清除能力和铁还原氧化能力几乎均低于25℃时的抗氧化活性，而其他4种提取试剂的提取物几乎随提取温度和时间的增加其抗氧化活性也随着增加。然而，从表1分析得出，仍然是25℃、120min时，甲醇-水-盐酸溶液(80∶19.9∶0.1)的提取物抗氧化活性最强。

表2 绿熟期草莓果实提取物抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of different solvent extracts from strawberry fruits

3 讨 论

溶剂极性对植物抗氧化物质的提取有着较大的影响。由于不同溶剂对植物抗氧化物质的溶解能力不同，从而导致提取物中抗氧化物质含量显著不同，因此选择适当的提取试剂是获得高含量抗氧化物质的重要因素之一。本实验选用几种较为常用的提取试剂对绿熟期草莓果实抗氧化物质进行提取，研究表明，总酚是草莓果实提取物中主要的抗氧化物质，并且甲醇-水-盐酸(80∶19.9∶0.1)是总酚提取较为适合的提取溶剂，甲醇、甲醇-乙醇-丙酮(1∶1∶1)、乙醇和水的效果次之(表1)。Gonzalez-Montelongo等[18]研究认为水提取物总酚含量低的原因可能是由于多酚氧化酶氧化酚类化合物所致，而含有甲醇或乙醇的溶液则抑制了多酚氧化酶的活性，从而提取物中总酚含量较高。

提取时间对绿熟期草莓果实抗氧化物质提取的影响并没有表现出规律性的变化，而温度却有着明显的影响。在25℃时更适合抗坏血酸的提取，而在60℃时则更有利于总酚和类黄酮的提取。这在葡萄皮、杨桃和香蕉皮抗氧化物质的提取过程中也有类似的报道[23-25]。大量研究认为，温度升高有助于提高溶剂的提取效率，其原因主要是扩散系数和溶剂中提取物的溶解性增大所致[18,26-27]。然而，并不是所有抗氧化物质的提取效率均在高温下更高。柑橘皮中酚类化合物含量并没有随提取温度的升高(40～100℃)而增加[28]。Liyana-Pathirana等[29]研究认为，在高温下，热稳定的抗氧化物质的提取速度高于难溶的抗氧化物质的降解速度是提取效率增加的主要原因。因此，只有含有较高比例热稳定的抗氧化物质样品才更适合在高温下进行抗氧化物质的提取[23]。

为获得较好的提取体系，提取物的抗氧化活性在本实验中也进行了测定与分析。提取物的抗氧化活性在不同溶剂和提取条件下显著不同，说明提取物中存在不同极性的抗氧化物质[18]。在实验中还观察到，抗氧化物质提取的最佳条件与获得最高抗氧化活性的提取条件并不一致，并且相关性分析表明，总酚含量与抗氧化活性之间的相关性较弱。这在黑糯米[13]、茜草科植物[26]和荞麦[16]抗氧化物质的提取研究中也有类似的结论。高含量的酚类化合物并没有表现出高的抗氧化活性，其原因主要是：第一，抗氧化活性的高低不仅受总酚含量的影响，也受酚类物质化学结构的影响[13,30]；第二，抗氧化物质的协同作用有可能削弱酚类物质与抗氧化活性之间的相关性[13,26]。因此，总酚含量的高低并不总是草莓果实提取物抗氧化活性强弱的指示剂。

小绿阶段草莓果实中含有丰富的抗氧化物质[11-12]。甲醇-水-盐酸(80∶19.9∶0.1)是草莓果实抗氧化物质提取较为适合的提取剂，不仅可以获得高含量的抗氧化物质，而且抗氧化物质的抗氧化活性较高。综合抗氧化物质的提取量以及提取物的抗氧化活性，甲醇-水-盐酸(80∶19.9∶0.1)在25℃、120min条件下进行草莓果实抗氧化物质的提取更为适合。

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Effect of Extraction Conditions on Antioxidant Components and Antioxidant Activity of Strawberry Fruit Extracts

LUO Ya，WANG Xiao-rong，ZHANG Yong，LIU Ze-jing，REN Yun-nan，YANG Tao，TANG Hao-ru*
(College of Horticultural, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Strawberry fruits from Fragaria ananassapicked at the green maturity stage were extracted with different solvents under varying conditions of temperature and extraction time and the extracts obtained were tested for their antioxidant components and antioxidant activity. The results showed that methanol-water-HCl (80∶19.9∶0.1, V/V) extract revealed a significant increase in the contents of total phenols, flavonoids and ascorbic acid, DPPH free radical scavenging activity and ferric ions reducing power when compared with methanol, ethanol, methanol∶ ethanol-acetone (1∶1∶1, V/V) and water extracts. The optimal extraction conditions (at 60 ℃ for 480 min) for achieving maximum extraction of antioxidant components did not accord with those (at 25 ℃ for 120 min) resulting in maximum antioxidant activity, indicating that the contents of antioxidant components did not necessarily represent the antioxidant activity of strawberry fruit extracts. Comprehensively considering the contents of antioxidant components and antioxidant activity of strawberry fruit extracts, we concluded that extraction with methanol-water-HCl mixture (80∶19.9∶0.1, V/V) for 120 min at 25 ℃ is more suitable for extracting antioxidant components from Strawberry fruits.

strawberry；fruit extract；extraction solvent；antioxidant component；antioxidant activity

S668.4

A

1002-6630(2011)14-0108-05

2010-09-27

四川省教育厅重点项目(07ZZ023；09ZB050)；四川农业大学“双支计划”项目(06370501)

罗娅(1979—)，女，副教授，博士，主要从事果树生物技术研究。E-mail：luoya945@163.com

*通信作者：汤浩茹(1963—)，男，教授，博士，主要从事果树生物技术研究。E-mail：htang@sicau.edu.cn