响应面法优化枳实中辛弗林的超声辅助提取工艺

张 璐，范杰平，曹 婧，孔 涛，童 声

(南昌大学环境与化学工程学院，江西 南昌 330031)

响应面法优化枳实中辛弗林的超声辅助提取工艺

张 璐，范杰平*，曹 婧，孔 涛，童 声

(南昌大学环境与化学工程学院，江西 南昌 330031)

在单因素试验的基础上，采用响应面法对超声波辅助提取枳实中生物碱辛弗林的工艺进行优化，预测得到最实验佳条件。结果表明：超声波法提取枳实中生物碱辛弗林的最佳工艺条件为枳实颗粒度30目、乙醇体积分数67.90%、液固比12∶1(mL/g)、提取时间16min、超声功率420W，在此条件下，辛弗林的提取量达到5.87mg/g。该工艺提取结果与理论预测值5.77mg/g基本吻合，说明该优化方法可行。

枳实；辛弗林；超声提取；响应面法

枳实为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种的干燥未成熟果实或甜橙的干燥幼果。主要含挥发油、辛弗林、N-甲基酪胺、橙皮甙、VC及VD等。始载于神农本草经，具有破气消积，化痰散痞之功效。辛弗林是积实中的一种生物碱，是枳实中起主要药理作用的有效成分，具有收缩血管、升高血压和较强的扩张气管、支气管的作用，能够提高新陈代谢、增加热量消耗、提高能量水平、氧化脂肪，并能缓解因肥胖引起的轻度和中度抑郁症状[1-3]。因此辛弗林广泛应用于医药、食品、饮料等保健行业。

由于该天然产物含量较低，而传统的提取工艺如煎煮法、热回流法等则有耗时长、提取率低等不足，所以应考虑采用一些新的物理辅助提取手段[4]。本实验采用超声波辅助方法对枳实中辛弗林的提取工艺进行研究，并在单因素试验的基础上，通过响应面法[5-9]对其工艺条件进行优化，为选择和制订枳实中辛弗林的提取工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枳实(生品)产自江西。

辛弗林标准品(纯度98.66%) 陕西森弗生物技术有限公司；甲醇(色谱纯)、无水乙醇(分析纯) 天津大茂化学试剂厂。

1100高效液相色谱仪(配有四元泵及自动进样器、DAD检测器) 美国安捷伦公司；KQ-600DB型数控超声波清洗器(超声频率40kHz、超声最大功率600W、功率可调40%～100%、加热最大功率800W、温度可调10～80℃) 昆山市超声仪器有限公司；FZ-102微型植物粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；KDC-160HR型离心机科大创新股份有限公司中佳分公司；FA2104型电子天平 上海伦捷机电仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枳实中生物碱辛弗林的提取

枳实经粉碎，筛分，烘干，备用。精密称取枳实样品0.5g，采用超声辅助提取法，用乙醇溶液提取枳实中生物碱辛弗林，将提取液用高速离心机离心20min。取上清液1mL，用甲醇定容至10mL，经高效液相色谱仪分析检测，进样前样品通过0.45μm的滤膜过滤。结果以提取率Y表示。

式中：C表示提取液辛弗林的质量浓度/(g/mL)；V表示加入溶剂的体积/mL；m为枳实的质量/g。

1.2.2 色谱条件

根据文献[10-12]条件，经过实验优化后，测定辛弗林的高效液体色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为甲醇∶缓冲盐溶液(0.02% H3PO4、0.1%十二烷基硫酸钠、0.02%三乙胺)= 60∶40，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长224nm。

1.2.3 标准曲线的绘制

精密称取辛弗林6mg，置10mL容量瓶中，加无水甲醇至刻度作为对照品溶液。分别进样0.2、0.5、1.0、2.0、3.0μL，测定其峰面积，绘制标准曲线，辛弗林的标准曲线回归方程为y=591.36057χ-16.0981(R2=0.9999)，式中，y为辛弗林峰面积/(mAU·s)、χ为进样量/μg。结果表明辛弗林在0.12～1.8μg范围内线性关系良好。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 粒度对提取率的影响

在乙醇体积分数65%、提取时间15min、液固比12∶1 (mL/g)、功率480W的条件下考察枳实粒度(20～60目)对提取率的影响，结果如图1所示。

由图1可知，当粒径为20目时辛弗林提取率最低，而当粒径为30目时提取率达到最高，随之，提取率随着粒径减小而下降。这是由于当粒径过大时，颗粒与溶剂之间的有效接触不好，从而影响提取效率；而当颗粒体积过小时，会有过多杂质溶出且颗粒容易成团，这将导致提取率下降。因此30目被选为最佳的粒径大小。

图1 粒度对提取率的影响Fig.1 Effect of material particle size on extraction yield of synephrine

2.1.2 乙醇体积分数对提取率的影响

在枳实粒度30目、提取时间15min、液固比12∶1、功率480W的条件下考察乙醇体积分数(35%～95%)对提取率的影响，结果如图2所示。

图2 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of synephrine

由图2可知，辛弗林产量随着乙醇体积分数的增加而提高，当乙醇体积分数为65%时，提取率达到最高，之后提取率随乙醇体积分数降低而下降。根据相似相溶原理，极性相似可以达到最大溶出度，当乙醇体积分数为65%时，其极性与辛弗林相似，因此65%乙醇为最佳提取溶剂。

2.1.3 液固比对提取率的影响

图3 液固比对提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction yield of synephrine

在枳实粒度30目、乙醇体积分数65%、提取时间15min、功率480W的条件下，考察液固比6∶1～14∶1(mL/g)对提取率的影响，结果如图3所示。

如图3所示，辛弗林提取率随着液固比的增大而提高，当液固比为12∶1时提取率达到最大，之后提取率随其增大而减小。这是由于过多的溶剂使得超声波对枳实的穿透作用减小，从而导致提取率下降。因此，12∶1被选为最佳的液固比。

2.1.4 提取时间对提取率的影响

在枳实粒度30目、乙醇体积分数65%、液固比12∶1、功率480W的条件下，考察提取时间(5～25min)对提取率的影响，结果如图4所示。

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of synephrine

由图4可知，辛弗林提取率随着提取时间的增加而增加，而当提取时间超过15min后，辛弗林提取率的变化已经很小。因此，从节省时间和能耗的角度考虑，选择15min为最佳提取时间。

2.1.5 超声功率对提取率的影响

在枳实粒度30目、乙醇体积分数65%、提取时间15min、液固比12∶1的条件下，考察超声功率(300～540W)对提取率的影响，结果如图5所示。

图5 超声功率对提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasound power on extraction yield of synephrine

由图5可知，辛弗林提取率随超声功率的增大而提高，当超声功率为420W时提取率达到最大，之后提取率随之增大而下降。随着超声功率增大，分子扩散速度越大，提取率增大，而当功率过大时，可能一些糖类和蛋白质等杂质也会溶出，辛弗林被吸附在固体基质上而不易被提取，从而导致提取率下降。因此，420W被选为最佳超声功率。

2.2 响应面法优化枳实有效成分辛弗林提取工艺

2.2.1 响应面分析方案及试验结果

通过单因素试验基础可知，乙醇体积分数(X1)、枳实粒度(X2)、提取时间(X3)为3个对枳实辛弗林提取率影响较大的因素。因此根据Box-Behnken试验设计，选取这3个因素对提取工艺进行响应面分析，以优化超声辅助提取枳实有效成分辛弗林的工艺条件，其具体试验方案及结果见表1。

表1 枳实有效成分辛弗林提取响应面分析方案及计算分析结果Table 1 Response surface design and corresponding experimental and predicted extraction yields of synephrine

2.2.2 模型的建立及其显著性检验

利用Design-Expert软件对表1试验数据进行二次多项式逐步回归拟合，得到模型为：Y=5.59＋0.52X1＋0.71X2＋0.35X3＋0.28X1X2＋0.033X1X3＋0.033X2X3---，模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察。

从表2方差分析结果可知，F=43.95，说明本试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P=0.0003＜0.05)。在总的作用因素中，回归方程一次项、二次项的P值均小于0.05，表明这两项均具有很高的显著性；交互项的P值大于0.05，说明这3个因素之间的交互作用不大。失拟项在P=0.05水平上不显著(P=0.1162＞0.05)，相关性系数R2=0.9875，说明模型能够很好的反应响应值的变化，拟合度好。可以用此模型来分析和预测超声波提取枳实有效成分辛弗林的工艺结果。

表2 回归模型各项方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 提取工艺的响应曲面分析与优化

图6 各两因素交互作用对提取率影响的响应面图Fig.6 Response surfaces showing the effects of material particle size and ethanol concentration, ethanol concentration and extraction time, and extraction time and material particle size on extraction yield of synephrine

比较图6可知，乙醇体积分数和粒度对辛弗林提取效果的影响较为显著，表现为曲线较陡，响应值变化较大，最佳值为乙醇体积分数67.90%、粒度32.33目；提取时间对响应值的影响较小，曲线较为平滑，对响应值变化较小，最佳值为提取时间16.38min。但考虑到实际操作的局限性，并结合表2方差分析的结果，将枳实提取工艺条件修正为乙醇体积分数67.90%、枳实粒度30目、提取时间16min。在此条件下，辛弗林的预测提取率可达到5.77mg/g。

在此修正条件下进行3次重复验证实验，辛弗林的提取量平均值达到5.87mg/g，与理论预测值基本吻合，表明响应面分析的优化结果与实际值相吻合，具有一定的实用价值。

2.3 超声辅助提取与热回流提取法的比较

为了评价超声辅助法提取辛弗林的效率，对比研究了超声辅助提取和热回流提取法的提取工艺，结果如表3所示。热回流法提取过程所需时间长、提取效率低，而超声波辅助提取法由于超声波产生的强烈振动及强烈空化效应使得细胞破碎，加大了颗粒和液体之间的接触面积，并加速药物有效成分渗透进入溶剂，从而获得更高的提取率，并且所需提取时间大大缩短[13-15]。超声辅助提取15min所得到的辛弗林的提取率比热回流提取2h的提取率还稍高。由此可见，超声波辅助提取在一定程度上可以提高生产效率、减小能量消耗，具有良好发展前景。

表3 超声辅助提取与热回流提取结果对比Table 3 Comparison of ultrasound-assisted extraction and reflux extraction of synephrine

3 结 论

综合各方面考虑，超声波辅助提取枳实中辛弗林是相比传统热回流提取法更为方便和有效的方法。超声波辅助提取有提取时间短、能耗小、提取效率高等优点。

采用响应面法对超声波辅助提取枳实中生物碱辛弗林工艺条件进行优化，得到最佳的提取工艺条件为枳实颗粒度30目、乙醇体积分数67.90%、液固比12∶1(mL/g)、提取时间16min、超声功率420W，此条件下辛弗林提取量可达5.87mg/g。

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Optimization of Ultrasound-assisted Extraction Process for Synephrine from Citrus aurantium Fruit by Response Surface Methodology

ZHANG Lu，FAN Jie-ping*，CAO Jing，KONG Tao，TONG Sheng
(School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

On the basis of one-factor-at-a-time experiments, response surface methodology was employed to the ultrasoundassisted extraction of synephrine from Citrus aurantium fruit. A quadratic regression model was established to investigate the extraction yield of synephrine with respect to three extraction parameters such as ethanol concentration, material particle size and ultrasound treatment time. The optimal extraction conditions determined were material particle size of 30 mesh, ethanol concentration of 67.90%, liquid-to-solid ratio of 12∶1 (mL/g), extraction time of 16 min, and ultrasonic power of 420 W. Under these conditions, the extraction yield of synephrine was up to 5.87 mg/g, which was consistent with the predicted value of 5.77 mg/g. Thus, the established regression model had good feasibility.

Citrus aurantium；synephrine；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2011)14-0001-05

2010-08-31

国家自然科学基金青年科学基金项目(20806037)

张璐(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为天然药物分离。E-mail：330031@163.com

*通信作者：范杰平(1974—)，男，副教授，博士，研究方向为化工分离和精细化工。E-mail：jasperfan@163.com