蚕蛹多糖脱蛋白方法研究

伍善广，赖泰君，孙建华，刘旭辉,3，童张法，廖丹葵,*

(1.广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2.柳州医学高等专科学校， 广西 柳州 545006；3.河池学院化学与生命科学系，广西 宜州 546300)

蚕蛹多糖脱蛋白方法研究

伍善广1,2，赖泰君1，孙建华1，刘旭辉1,3，童张法1，廖丹葵1,*

(1.广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2.柳州医学高等专科学校， 广西 柳州 545006；3.河池学院化学与生命科学系，广西 宜州 546300)

以蛋白去除率和多糖损失率为指标，比较Sevag法、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevag联用法和木瓜蛋白酶-TCA联用法脱除蚕蛹多糖蛋白的效果。结果显示：木瓜蛋白酶-TCA联用效果最好，其脱蛋白的最佳条件为木瓜蛋白酶用量[E]/[S] 2.0%、酶解温度50℃、酶解反应1.5h、采用TCA法除蛋白1次，此时蛋白去除率为97.98%，多糖损失率为18.76%；紫外光谱扫描定性实验显示脱蛋白的多糖在260～280nm处只有少量吸收，表明大多数蛋白已去除。木瓜蛋白酶-TCA联用法是一种有效的多糖脱蛋白方法。

蚕蛹；多糖；蛋白；脱除

近年来，多糖所具有的各种生理功能逐渐为人们所重视，如增强免疫力、降低血糖浓度、降血脂、抗肿瘤、抗疲劳及抗衰老等[1-6]。多糖具有的生理功能与其结构密切相关，从天然动植物提取的多糖，往往含有大量的蛋白质，蛋白的存在不仅可能影响其结构和生物活性的研究，且可能导致药理作用下降。因此，在天然多糖的提取、分离纯化及结构研究中，脱蛋白是一个重要的环节。由于多糖常常与蛋白形成糖蛋白复合物，使蛋白质的脱除比较困难[7]。国内外对粗多糖脱蛋白方法研究较多的有三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法、Savag法和酶法等[8-10]。以往研究发现TCA法脱蛋白时多糖损失较大[11]，Sevag法需要反复多次使用，且可能导致部分多糖水解[12]。采用化学法与酶法联用，由于酶可以使大部分的游离蛋白质和部分结合蛋白水解，减少了后续有机溶剂除蛋白的次数，从而降低了多糖随凝胶物沉淀而损失的可能，可以获得较好的效果[13]。

蚕蛹(silkworm pupa)为蚕蛾科昆虫家蚕蛾(Bombyχ moil L.)的蛹[14]，为药膳同源传统中药材，具有很高的营养和药用价值。蚕蛹多糖是蚕蛹中的主要活性成分之一，药理实验表明，蚕蛹多糖具有明显增强机体免疫功能的作用[15-18]。本实验室对水提醇沉法提取蚕蛹多糖的工艺进行研究[19]，但该方法所获得的蚕蛹粗多糖中含有一定量的蛋白质。基于不同脱蛋白方法的特点，本实验分别采用Sevag法、三氯乙酸法(TCA法)、酶法以及两法联用进行脱蛋白研究，考察脱蛋白工艺，以确定适于蚕蛹多糖脱蛋白的方法，为进一步分离纯化蚕蛹多糖提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蚕蛹粗多糖(多糖含量为质量百分比16.9%) 自制；牛血清蛋白 美国Sigma公司；木瓜蛋白酶(酶活为36万U/g) 南宁市庞博生物技术公司；其他试剂为分析纯。

BS110S型分析天平 北京赛多利斯仪器有限公司；H-1650型高速离心机 长沙湘仪离心机有限公司；UV-2102P型紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司。1.2脱蛋白实验

1.2.1 Sevag法脱蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，加入其体积1/5的Sevag试剂(V正丁醇∶V氯仿，1/5)，剧烈振摇20min，4000r/min离心，取出部分上层水溶液，得第1次脱蛋白多糖溶液，水溶液重复上述操作。取5份样品，用上述步骤分别处理1、2、3、4、5次，测定不同处理次数蛋白去除率和多糖损失率。

1.2.2 三氯乙酸法(TCA法)脱蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，分别加入等体积TCA溶液使其体积分数分别为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，90r/min振荡20min，静置1h，4000r/min离心15min并弃去沉淀。确定脱蛋白效果最好的TCA体积分数后，考察TCA法不同脱蛋白次数的效果。

1.2.3 木瓜蛋白酶法脱蛋白

取5管1g/100mL粗多糖溶液(50mL/管，下同)放入37℃水浴锅中预热10min，加入蛋白酶在一定温度下酶解一定时间，反应结束后将反应瓶放入100℃沸水浴中灭酶10min，冷却至室温，测定溶液中蛋白含量和多糖含量。采用单因素试验法，分别考察蛋白酶加入量([E]/ [S])、酶解温度以及酶解时间对蚕蛹多糖的脱蛋白的影响，以获得最佳酶法脱蛋白条件。

1.2.4 木瓜蛋白酶法与Sevag法联用脱蛋白

将1g/100mL粗多糖溶液50mL于37℃水浴锅中预热10min，按1.2.3节得到的木瓜蛋白酶脱蛋白最优条件进行脱蛋白实验，再按1.2.1节Sevag法脱蛋白所述实验条件脱蛋白1次后，上层水溶液即为木瓜蛋白酶法-Sevag法联用脱蛋白多糖溶液。

1.2.5 木瓜蛋白酶法与TCA法联用脱蛋白

取1g/100mL粗多糖溶液50mL，于37℃水浴锅中预热10min，按1.2.3节得到的木瓜蛋白酶脱蛋白最优条件进行脱蛋白实验，再用1.3.2节TCA法脱蛋白最优条件处理1次，溶液经4000r/min离心15min弃去沉淀，即得木瓜蛋白酶法-TCA法联用脱蛋白多糖溶液。

1.3 蛋白质及多糖含量测定方法

1.3.1 蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[20]，用牛血清蛋白作标准曲线，牛血清白蛋白质量浓度C与吸光度A之间的回归方程为A=0.005C＋0.0362(r=0.9984)，线性范围20.0～100.0μg/mL。

1.3.2 多糖含量的测定

蚕蛹多糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法[9]，用葡萄糖作标准曲线，总糖质量浓度C与吸光度A之间的回归方程为A=13.414C＋0.0063(r=0.9988)，线性范围为0.01～0.06mg/mL。

称取粗多糖配制成含量约为1g/100mL的溶液，按照上述各脱蛋白方法进行脱蛋白处理，并将处理后所得溶液真空干燥至质量恒定，分别测定蛋白质及多糖含量，按下式计算蛋白去除率和多糖损失率。

式中：Ri为粗多糖中蛋白质量/g；Rj为除蛋白处理后样品中蛋白质量/g。

式中：Ti为粗多糖中多糖质量/g；Tj为除蛋白处理后样品中多糖质量/g。

1.4 蚕蛹多糖除蛋白质方法的定性分析

分别称取原料粗多糖、最优脱蛋白方法制备得到的蚕蛹多糖各100mg，用蒸馏水溶解定容至50mL，对溶液进行紫外光谱扫描。

2 结果与分析

2.1 Sevag法脱蛋白效果

由图1可知，蛋白去除率随着脱蛋白次数增加而上升，而多糖损失率则变化不大，其中Sevag法处理5次后，蛋白质去除率为30.20%、多糖损失率为10.14%，即大部分蛋白仍与多糖结合未能去除。

图1 Sevag法脱除蚕蛹多糖蛋白质的效果Fig.1 Effect of number of Sevag deproteinizations on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.2 三氯乙酸法(TCA法)脱蛋白效果

图2 三氯乙酸(TCA)法脱蛋白效果Fig.2 Effect of TCA concentration and number of deproteinizations on protein removal rate and polysaccharide loss rate

由图2A可看出，随着TCA体积分数的增加，蛋白去除率升高先后降低，当TCA体积分数为3.0%时脱蛋白效果最好，蛋白去除率为59.41%、多糖损失率为5.14%。由图2B可以看出，蛋白去除率和多糖损失率均随着脱蛋白次数增加而增大，脱蛋白2次蛋白去除率达75.52%，但多糖损失率则达18.61%。脱蛋白3次时蛋白脱除率达80.66%、多糖损失率为22.84%。

2.3 木瓜蛋白酶法脱蛋白效果

由图3可知，粗多糖蛋白质去除率随着酶用量的增加而增加，但当酶用量[E]/[S]超过2.0%后，蛋白质去除率增加不明显；随着酶解温度的升高，蛋白质去除率则表现为先升后降，酶解温度50℃时蛋白质去除率最高；随着酶解时间延长蛋白质去除率增大，当酶解1.5h后蛋白脱除率变化不明显。

综上所述，木瓜蛋白酶脱蛋白的最佳工艺条件为酶用量[E]/[S] 2.0%、酶解温度50℃、酶解反应时间1.5h，此时蛋白质去除率为80.52%，多糖损失率为9.94%。

图3 木瓜蛋白酶法去蛋白效果Fig.3 Effect of papain dosage, hydrolysis temperature and hydrolysis time on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.4 各种方法脱蛋白效果比较

图4 各种脱蛋白方法的结果比较Fig.4 Comparisons of protein removal rates and polysaccharide loss rates obtained by different deproteinization methods

各取1g/100mL粗多糖溶液50mL，分别用Sevag法(处理5次)、三氯乙酸法(处理3次)、木瓜蛋白酶法(酶法)、木瓜蛋白酶-Sevag联用法(酶-Sevag法，其中Sevag法处理3次)和木瓜蛋白酶-TCA联用法(酶-TCA法，其中TCA法处理1次)进行脱蛋白处理，结果见图4。可以看出，木瓜蛋白酶-TCA联用法蛋白去除率最高，而Sevag法蛋白去除率最低。采用传统Sevag法对粗多糖进行5次处理后，虽然多糖损失率只有10.14%，但是蛋白去除率是5种方法中最低的。木瓜蛋白酶-TCA联用法比单一方法具有更好地除蛋白效果，蛋白去除率高达97.98%，多糖损失率18.76%。

2.5 蚕蛹多糖除蛋白质方法的定性分析

图5 蚕蛹粗多糖(A)和木瓜蛋白酶-TCA联用法脱蛋白蚕蛹多糖(B)的紫外-可见光光谱图Fig.5 UV-visible scanning spectra of silkworm pupa polysaccharides before and after deproteinization by papain-TCA method

由图5可知，蚕蛹粗多糖在190～300nm范围内吸光度均保持较大的值，木瓜蛋白酶-TCA联用法脱蛋白蚕蛹多糖在260～280nm蛋白质特征吸收区的吸收明显降低，表明绝大部分蛋白已经脱除，仅有少部分蛋白与多糖紧密结合形成糖肽或糖蛋白难以去除。

3 结 论

本实验分别考察了Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevag联用法和木瓜蛋白酶-TCA联用法脱除蚕蛹多糖蛋白的效果。结果表明，木瓜蛋白酶-化学联用法脱除蚕蛹多糖蛋白效果明显优于单一的脱蛋白方法，其中木瓜蛋白酶-TCA联用法脱除蚕蛹粗多糖中的蛋白效果最好，经1次处理蛋白去除率和多糖损失率分别为97.98%和18.76%，基本能将粗多糖中的蛋白除去，同时并没有增加多糖的损失，可得到比较理想的脱蛋白效果。该法效果良好、操作简单，是一种值得推广使用的脱蛋白方法。

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A Comparative Investigation into Deproteinization Methods for Silkworm Pupa Polysaccharides

WU Shan-gang1,2，LAI Tai-jun1，SUN Jian-hua1，LIU Xu-hui1,3，TONG Zhang-fa1，LIAO Dan-kui1,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China；2. Liuzhou Medical College, Liuzhou 545006, China；3. Department of Chemistry and Life Science, Hechi University, Yizhou 546300, China)

Protein removal rate and polysaccharide loss rate were used to evaluate and compare the effectiveness of Savag, s method, trichloroacetic acid (TCA) method, papain method and papain-TCA (papain hydrolysis followed by TCA precipitation) method in deproteinizing silkworm pupa polysaccharides. Papain-TCA method was found to be the best method for the deproteinization of silkworm pupa polysaccharides, and the optimal operating conditions were 1.5 h hydrolysis with papain at an enzyme-to-substrate of 2.0% and 50 ℃ followed by once treatment with TCA. A protein removal rate of 97.98% and a polysaccharide loss rate of 18.76% were achieved under such conditions. Only one absorption peak was observed in the UV-visible scanning spectrum of deporteinized silkworm pupa polysaccharides, indicating the removal of almost all proteins.

pupa；polysaccharide；protein；removal

R284.2

A

1002-6630(2011)14-0021-04

2010-08-25

广西自然科学基金项目(桂科自0728237)；广西壮族自治区教育厅科研项目(200607MS031)；广西大学基金项目(X071029)

伍善广(1974—)，男，博士研究生，研究方向为药物新剂型。E-mail：wusg1974@163.com

*通信作者：廖丹葵(1967—)，女，教授，博士，研究方向为精细化工、中草药有效成分提取。E-mail：liaodk@gxu.edu.cn