pH敏感的壳聚糖接枝聚合物的可控合成及载药性能研究

钱 骏，姜 晶，曾泽华，陈 阳，潘晓娣，曹金鑫，华道本

（苏州大学材料与化学化工学部高分子科学与工程系，江苏苏州 215123）

pH敏感的壳聚糖接枝聚合物的可控合成及载药性能研究

钱 骏，姜 晶，曾泽华，陈 阳，潘晓娣，曹金鑫，华道本

（苏州大学材料与化学化工学部高分子科学与工程系，江苏苏州 215123）

壳聚糖由于具有良好的生物相容性和可生物降解性，在生物医药等领域得到了广泛的应用。笔者利用邻苯二甲酰化壳聚糖RAFT聚合法合成了pH敏感的壳聚糖接枝聚丙烯酸2-羟乙酯。壳聚糖氨基可以与羧基等进行反应，用来包裹含羧基的疏水药物（如萘普生等）。由于壳聚糖在水溶液中的溶解具有pH依赖性，该接枝聚合物可以作为具有pH响应的载药体进行药物输送。

壳聚糖 可控改性 药物输送 RAFT聚合

壳聚糖是一种生物相容的、可生物降解和无毒害的天然多糖，在生物医用等许多领域都得到广泛的应用［1，2］。但是由于壳聚糖分子间存在氢键使其结晶度高，所以不溶于一般的有机溶剂，这大大限制了壳聚糖的应用。因此许多化学家都致力于壳聚糖的改性研究，并取得了许多进展［3］。近年来，由于在合成结构明确、分子质量可控高分子方面的优点，可控／活性自由基聚合用于壳聚糖的合成改性也得到了较多的研究。壳聚糖的接枝聚合物不仅具有壳聚糖的特点，而且具有合成聚合物的优点，这使得壳聚糖的应用范围可以得到很好地拓宽。El Tahlawy、Lindqvist和Liu等分别利用原子转移自由基聚合（ATRP）方法对壳聚糖进行了接枝改性［4-6］，然而体系中残存的金属催化剂限制了其在生物医药方面的应用。笔者所在课题组近年来在壳聚糖改性中发展了可逆加成断裂链转移（RAFT）聚合方法［7］，并将其应用于温度敏感性壳聚糖接枝聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的合成［8］。

为了拓展其适用性，笔者利用RAFT聚合法合成了pH响应的壳聚糖接枝聚丙烯酸羟乙酯（PHEA），并将其用于带羧基药物的可控输送研究。首先将邻苯二甲酸酐与壳聚糖上的氨基进行反应生成邻苯二甲酰化壳聚糖，以增加其在有机溶剂中的溶解度，然后将S-1-十二烷基-S′（α，α′-二甲基-α″-乙酸）三硫代碳酸酯（DDACT）和邻苯二甲酰化壳聚糖进行酯化反应生成大分子RAFT试剂，来控制丙烯酸2-羟乙酯的聚合，从而制备邻苯二甲酰化壳聚糖接枝聚丙烯酸2-羟乙酯（PHCS-g-PHEA），最后肼解脱保护氨基，用于带羧基等药物的负载和输送。合成路线如反应式1所示。

1 试 验

1.1 试剂原料

试剂原料如表1所示。

表1 试剂原料

反应式1 负载萘普生药物的壳聚糖接枝聚丙烯酸2-羟乙酯的合成路线

2.2 壳聚糖的邻苯二甲酰化

将壳聚糖（脱乙酰度95%，200KDa）和邻苯二甲酸酐按照摩尔比1∶3（其中壳聚糖的摩尔质量为0. 02 mol），投料于100 mL的DMF中，在110℃下反应8 h后，用冰水沉淀，离心得到粗产物。将该产物用乙醇抽提24 h。真空干燥，研磨待用。

2.3 壳聚糖大分子RAFT试剂的制备

该实验所用的RAFT试剂S-1-十二烷基-S′（α，α′-二甲基-α″-乙酸）三硫代碳酸酯（DDACT）是根据文献方法［9］制得。将所得的邻苯二甲酰化的壳聚糖溶于100 mL DMF后，加入三硫代碳酸酯（DDACT）和二环己基碳二亚胺（DCC），三者的投料摩尔比为1∶1∶1.5（其中DDACT的摩尔质量为7.50 mmol）。在室温下反应24 h后，体系由完全溶解状态变为黄色浑浊溶液，用乙醇沉淀，离心得初产物。该产物用乙醇抽提除去未反应的DDACT、脲和残余的DMF。真空干燥，产率为86%。

2.4 邻苯二甲酰化壳聚糖的接枝改性

将所得的壳聚糖大分子RAFT试剂（0.72 g）溶于28 mL DMF，加入偶氮二异丁腈（AIBN）（0.02 g）和丙烯酸2-羟乙酯（HEA）（3.60 g），均分于2个反应瓶，通氩气15 min，在60℃下分别反应3.5 h、7.0 h，反应结束后用乙醚沉淀，得到的产物用丙酮抽提。抽提所得的固体为保护的壳聚糖接枝聚合物（PHCS-g-PHEA），而圆底烧瓶中的抽提液旋干后所得的聚合物即为HEA的均聚物（PHEA）。接枝率可根据以下公式计算：

G＝（Wg-W0）／W0

这里Wg和W0分别为接枝聚合物和RAFT试剂的质量。

2.5 PHCS-g-PHEA肼解脱保护

将所得的PHCS-g-PHEA（时间＝7 h）0.30 g溶于15 mL DMF中，加入水合肼50 μL，在100℃下反应2 h后，用乙醚沉淀，再用乙醇抽提24 h，除去肼解下来小分子和PHEA。壳聚糖接枝聚合物（CS-g-PHEA）的质量为0.24 g，产率为78%。

2.6 CS-g-PHEA载药性能的研究

将萘普生0.010 0 g溶于2 mL DMF与2 mL CS-g-PHEA（2.4 mg／mL）的DMF溶液混合12 h。取4. 0 mL的水缓慢滴加于4.0 mL上述溶液中，然后置于透析袋（WMCO＝3 500）中透析，每隔一定时间，更换透析袋外的液体，渐有白色固体析出。20 h后，倒出透析袋内液（18.0 mL），静置，取上层清液。

取3 mL上述液体置于透析袋（WMCO＝3 500）中释放，外部液体分别是pH为7.2和5.6的缓冲液100 mL，在设定的时间取出10 mL外部液体，同时添加10 mL缓冲液。将所取出的外部液体测荧光（激发波长λ exciting＝310 nm，狭缝宽度slit＝4 nm）强度，根据标准曲线计算出萘普生药物的浓度及释放量。

2.7 表征方法

1H NMR谱图在INOVA 400MHz核磁共振仪上以DMSO-d6为溶剂，TMS为内标测定。红外光谱（FTIR）采用Mangna-550N icocet红外光谱仪测定，KBr压片法。聚合物（PNIPAM，PHEA）的分子质量和分子质量分布指数使用waters 1515凝胶色谱仪（GPC）测定，使用RI 2414检测器，柱子型号为MZGel SDplus 500A，10E3A，10E4A，以（DMF＋0.05 mol／L LiBr）为流动相，流速0.8 mL·min-1，在30℃测定，分子质量以聚苯乙烯标样校正。扫描电子显微镜SEM采用Hitachi S-570型SEM，测试电压20 kV。荧光测定是在HORIBA公司生产的Fluoromax-4上完成的。

3 结果与讨论

3.1 壳聚糖RAFT试剂的合成

根据反应式1合成了邻苯二甲酰化壳聚糖RAFT试剂（PHCS-RAFT），图1给出了其在DMSO-d6中的核磁谱图。在δ＝1.20 ppm左右是RAFT试剂DDACT上氢的峰，说明成功制备了大分子RAFT试剂。通过对核磁特征峰进行积分，可以计算出大约6个壳聚糖重复单元接一个DDACT。元素分析数据进一步证实了这个结果，见表1所示。

图1 邻苯二甲酰化壳聚糖RAFT试剂的核磁共振氢谱（300 MHz，DMSO-d6）

表1 元素分析数据

图2是壳聚糖、邻苯二甲酰化壳聚糖和壳聚糖大分子RAFT试剂的红外谱图。与壳聚糖（图2（a））相比，邻苯二甲酰化壳聚糖（图2（b））在725 cm-1出现了邻苯二甲酸酐苯环C—H振动峰，并且在1 720 cm-1处的强吸收峰是壳聚糖上氨基与邻苯二甲酸酐酰化后形成的酰亚胺键的==CO振动峰；壳聚糖大分子RAFT试剂（图2（c））在2 800～3 000 cm-1处峰强明显增强，是由于RAFT试剂上甲基（—CH3）和亚甲基（—CH2）的作用，而1 520 cm-1处的小峰可能是—S—==CS键的振动形成的。这些结果都说明按照前述方法可以成功合成邻苯二甲酸化壳聚糖RAFT试剂。

图2 红外光谱比较

3.2 邻苯二甲酰化壳聚糖接枝聚合物的合成

根据RAFT机理，共聚物链上连接的增长链自由基与溶液相中分散的增长链自由基是一个动态的平衡，因此，溶液相中的均聚物可以用来间接表征接枝聚合物的分子质量和分子质量分布。图3给出了聚合体系中均聚物的GPC曲线，可以看出图谱基本呈正态分布，分子质量分布较窄，且随着聚合时间的延长分子质量增大，这些都说明聚合反应基本上按RAFT过程进行。

图3 聚合体系中均聚物聚丙烯酸2-羟乙酯的GPC曲线

利用核磁共振氢谱确认了接枝聚合物的结构。图4是壳聚糖接枝聚合物（PHCS-g-PHEA）的核磁谱图。在δ＝4.00 ppm处的峰是PHEA支链上靠近酯基的亚甲基（—CH2）峰，在δ＝3.60 ppm是PHEA侧链上与羟基直接相连的亚甲基（—CH2）峰，在δ＝4.80 ppm附近的是PHEA上羟基（—OH）的峰；δ＝1.60 ppm左右是主链上亚甲基（—CH2）和甲基（—CH3）的峰。这些结果表明成功制备了壳聚糖接枝聚合物。

图4 邻苯二甲酰化壳聚糖接枝聚丙烯酸2-羟乙酯（t＝7 h）的核磁共振氢谱（300 MHz，DMSO-d6）

3.3 萘普生药物的负载及释放

邻苯二甲酰化壳聚糖接枝聚合物通常可以用水合肼来肼解脱保护［10］，得到氨基脱保护的壳聚糖接枝聚合物。壳聚糖氨基可以与羧基等进行成盐，用来包裹含羧基的疏水药物（如萘普生等）（反应式1），而且壳聚糖在水溶液中的溶解性具有pH依赖性，所以该接枝聚合物期望能够作为具有pH响应的载药体进行药物输送。

图5 负载萘普生药物的壳聚糖接枝聚丙烯酸2-羟乙酯的核磁共振氢谱（300 MHz，DMSO-d6）

图5是壳聚糖接枝聚合物负载有萘普生药物的核磁谱图。在δ＝7.30 ppm附近的3个小峰是萘环上的氢，说明萘普生药物与CS-g-PHEA络合成功。通过荧光分析可知其载药量（DLC）为5.63%和载药率（DLE）为1.37%。

将载药的壳聚糖接枝聚合物置于去离子水中透析，可以形成100 nm左右的纳米粒子（图6）。在不同pH缓冲液中考察萘普生药物的释放行为（图7），可以发现CS-g-PHEA载药体系具有pH响应性，体系酸性的增加有利于药物的释放。

图6 负载萘普生药物的壳聚糖接枝聚丙烯酸2-羟乙酯的SEM图

图7 负载萘普生药物的壳聚糖接枝聚丙烯酸2-羟乙酯在pH响应的释放曲线

4 结 论

笔者利用邻苯二甲酰化壳聚糖RAFT试剂，制备出生物相容的壳聚糖接枝聚合物，由于其是两亲性接枝聚合物，并且壳聚糖的溶解性具有pH响应性，所以可以在水中进行自组装，制成具有pH响应性的纳米粒子。以萘普生为疏水模型药物，其结构中的羧基与壳聚糖上的氨基相互作用，在接枝聚合物自组装过程中，萘普生药物随着壳聚糖被包裹在纳米粒子核内。通过SEM可以发现，CS-g-PHEA在中性水溶液中能较好地进行组装，形成直径为100 nm左右的纳米粒子。释放实验表明可以通过改变缓冲液的pH值，可以调节萘普生药物的释放速率。

致谢：感谢国家自然科学基金（50903060）、教育部博士点基金（20093201120004）。

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Controlled synthesis of pH-sensitive chitosan graft copolymer for drug delivery

Qian Jun，Jiang Jing，Zeng Zehua，Chen Yang，Pan Xiaodi，Cao Jinxin，Hua Daoben

（Department of Polymer Science and Engineering，College of Materials，Chemistry and Chemical Engineering，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China）

Due to its biodegradability and biocompatibility，there has been many applications of chitosan in biomedical field.Here we report that pH-sensitive chitosan graft copolymers were synthesized via RAFT polymerization of 2-hedroxyethyl acrylate.The amino group of chitosan can be reacted with carboxyl group，which can be used to package the drugs with carboxyl group，such as Naproxen.The graft copolymer may be expected to act as pH-sensitive nanocarrier for drug delivery because of the pH-dependent solubility of chitosan.

chitosan；controlled modification；drug delivery；RAFT polymerization

O636.1

：A

：1006-334X（2011）02-0019-06

2011-06-11

钱骏，男，江苏苏州人，研究方向为天然高分子、绿色化学等。