动物组织线粒体DNA研究进展

樊贺明 杨明妍 毕峰

线粒体基因组也叫线粒体DNA(mtDNA，Mitochondrial DNA)，结构与细菌DNA相似，呈双链环状，可独立编码一些蛋白质，是核外遗传物质，人们在线粒体中已发现RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖体等全套装备，说明线粒体具有独立的遗传体系。

1 mtDNA的构成

mtDNA分子为环状双链DNA分子，外环为重链（H），内环为轻链（L）。基因排列非常紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。每个线粒体含数个mtDNA，动物组织mtDNA约16～20kb，大多数基因由H链转录，包括2个rRNA，14个tRNA和12个编码多肽的mRNA，L链编码另外8个tRNA和一条多肽链。mtDNA上的基因相互连接或仅间隔几个核苷酸序列，一些多肽基因相互重叠，几乎所有阅读框都缺少非翻译区域。很多基因没有完整的终止密码，而仅以T或TA结尾，mRNA的终止信号是在转录后加工时加上去的。

2 mtDNA的组成特点

mtDNA是一共价闭合的双链环状遗传物质,具有分子量小、结构简单、易于分离、拷贝数高、突变率高、进化速度快、母性遗传、无组织特异性等特点。其分子大小在14～42kb之间，绝大多数介于16～18kb,mtDNA已被广泛应用于发病机理、临床诊断、遗传变异、生物进化等多方面的研究，并已在分类学、种系鉴定、遗传学、进化论等领域取得一定的成就[1]。对大量不同动物(包括人在内的13种哺乳动物、2种鸟类、2种两栖类、6种鱼类、4种爬行类、6种昆虫类等) 线粒体基因组全序列测定表明, 动物线粒体基因由大致为15～20kb的双链环状DNA分子组成。双链3′端是一段具有二级结构的高保守性控制区,控制线粒体DNA的复制和转录。这一区域多是串联重复序列，并在核DNA上有同源区。它与转座、错配表达和线粒体基因异质(heteroplasmy)相关[2-3]。

3 mtDNA的结构特点

mtDNA结构基因排列紧凑,几乎没有间隙序列和内含子。在编码脯氨酸和苯丙氨酸tRNA的基因之间,由少数碱基构成一个突出结构—D环,它由与轻链互补的一小段DNA合成,并在这一区域取代了重链。D环是mtDNA与细胞核相联络的重要区域,也是mtDNA复制与转录的关键部位。该区在人、鼠、猪的mtDNA中是相当保守的,可形成一种发夹样次级结构。这一结构可与线粒体引发酶、γ-DNA-多聚酶和线粒体拓外异物酶Ⅰ和Ⅱ等强烈结合[4]。

4 mtDNA 的制备方法

mtDNA制备方法是国内外研究的热点，目前已有较多报道，可分为：超速离心法、差速离心法、碱裂解法和柱层析法。现将国内外几种较好的提取组织线粒体DNA的方法进行比较[5]。

4.1 非离子型去污剂法

戴纪刚等利用非离子型去污剂TrionX-100能溶解除核膜以外的所有细胞膜的特点，建立了一种通过核质分离技术制备mtDNA的方法。通过适当的离心，分离细胞核/细胞质来获取mtDNA。其主要优点是不需要分离细胞的总DNA，也不需要分离和纯化细胞线粒体，而是从完整细胞直接分离mtDNA，方法简单快速，对实验设备和试剂要求不高，一般实验室均可应用。由此可见，本方法制备mtDNA完全可以满足常规的研究工作的需要。

4.2 差速离心法

朱克军等[6]以差速离心法分离线粒体,用碱性SDS法裂解线粒体膜,释放线粒体DNA后用酚/氯仿抽提,TE或ddH2O溶解，然后将所得线粒体DNA进行纯度鉴定，并和其他方法制备的线粒体DNA经PCR进行扩增,比较扩增效果。

4.3 密度梯度离心法

密度梯度离心法纯化DNA是一种广泛应用的方法，其突出优点是获得的DNA纯度高。但经典的等密度梯度离心法的离心时间需要48～60h，实验周期长，仪器损耗大，对于电压不稳的实验室，这个问题还直接危及仪器的安全，而且，DNA样品长时间暴露在高浓度的盐(如CoCI)溶液中，容易受损伤。徐秀英等[7]采用两级梯度离心法纯化DNA，离心时间只需5h，离心效果与48h经典的密度梯度离心法无明显差别，达到了快速纯化的目的。

4.4 碱裂解法

碱裂解法，即SDS碱裂解法。其主要原理是通过使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基磺酸钠包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心后即可从上清中回收质粒DNA。(1)Tamura等[8]通过改进提取质粒DNA的碱裂解法来提取线粒体DNA,优点是简便快捷，缺点是微量制备，如果要检测大量个体，碱裂解法就会显得非常麻烦和费时。(2)刘丽红等[9]提出了一种直接以组织细胞制备mtDNA的技术方法，其优点:①对实验设备和试剂要求不高,一般实验室均可应用。②该方法对标本要求不高，-70℃冰冻保存或液氮保存即可。③mtDNA产率有极大提高,mtDNA样品紫外分光光度检测结果表明,每克组织可获得约8μg mtDNA。④不需要分离细胞的总DNA，也不需要分离和纯化细胞线粒体,而是从完整细胞直接分离mtDNA。因此,本方法简便快速,仅需2～3h,重复性好。⑤本方法尤其适用于标本量少,经费不足时mtDNA模板的制备。⑥用本方法所得mtDNA样品纯度高。

4.5 柱层析法

层析分离技术是一种物理的分离方法、它利用混合物中的各组分物理化学性质的差别（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），各组分以不同程度分布在两相中，从而使各组分以不同速度移动而达到分离。柱层析法是利用各分子形状和大小不同，在层析柱中的流速不同而将各组分分离。此方法操作简单，效果好，重复性高，应用广泛。常用于线粒体分离[10]。

人类及绝大多数哺乳动物细胞mtDNA都是闭环双链DNA分子。动物组织线粒体DNA的提取方法依其动物本身组织的不同特点，从方法学研究角度看,对新鲜动物线粒体DNA提取分离方法常用的有酚氯仿萃取、乙醇沉淀、CsC1超速离心、酸性缓冲液、碱性缓冲液等[11]。而对中药材来说,DNA一般因加工、干燥、储藏等过程部分降解同时易受到细胞中抑制PCR的蛋白质、多糖类、多酚类成分的影响,在提取DNA时加入SDS等蛋白质变性剂,在PCR时加入小牛血清蛋白(BSA)以灭活内源性核糖酶,排除干扰PCR的色素物质[12-13]。

分子遗传学标记技术为中药材与易混品种的鉴别提供了一条新的途径[14]。线粒体DNA（mtDNA）作为遗传信息的载体，是研究动物起源进化及对群体进行遗传分析的理想对象，线粒体细胞色素b[15-16]（cytb）基因进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究[17]。

5 应用前景

我国虽有丰富的中草药资源，但由于缺乏系统的整理和归类，致使中药材同名异物、同物异名的现象屡有发生；中药商品市场混乱，多有以假充真、以次充好的情况；随着人们“回归自然”迫切需求，中药需求量的日益扩大，资源矛盾日趋尖锐。而解决这些问题的关键是要有一套简便快速、准确有效的鉴别中药材正品的技术与方法，以杜绝假、劣及混淆品的干扰；找出形成质量优、产量高的道地药材的机制，明确其生长条件，以培育出更多优质的重要原材料；对于珍稀、濒危动植物，则需要大力保护，积极寻找替代品，或根据习性进行人工栽培和繁殖[18]。

目前，分子生物学技术已成为中药DNA指纹图谱鉴定的一项主要技术，DNA分子标记技术在中药鉴定和质量检测方面均有其独到的优势和广阔的应用前景，但仍需完善[19]。而动物mtDNA的研究已广泛渗透到保护生物学、系统学、分类学等学科中。早期的mtDNA的研究主要集中于限制性片段长度多态性分析（RFLP），近年来，随着DNA测序技术的成熟和普及，mtDNA的研究不断深入，应用日趋广泛[20]。

总之，DNA指纹图谱技术具有快速、微量、特异性强等特点，且不受生长发育阶段、供应部位、环境条件的影响，已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景，并保持了强劲的发展势头[21]。

[1] 戴纪刚,吴宇,魏泓,等.一种简单快速制备动物线粒体DNA的方法[J].第三军医大学学报,2000,22(4):391-392.

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[3] 廖顺尧,鲁成.动物线粒体基因组研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(5):508-512.

[4] 苟德明,王智新.动物线粒体DNA特性及其多态性研究进展[J].遗传育种,1996,22(4):7-10.

[5] 闫华超,贾少波,许恒龙,等.动物线粒体DNA提取简易流程及其优化[J].生物技术通讯,2007,18(1):95-97.

[6] 朱克军,汪振诚,王学敏,等.一种改进的提取人外周血和组织线粒体DNA的方法[J].第二军医大学学报,2004,25(04):444-446.

[7] 徐秀英,黄翠芬.快速密度梯度离心法纯化质粒DNA[J].军事医学科学院院刊1986,10(6):481-484.

[8] Tumura K, T Aotsuka. Rapid Isolation Method of Animal mitoc-hondrial DNA by the Alkaline lysis procedure[J].Biochem Genct,1988,26(11-12):815-819.

[9] 刘丽红,胡义,贾立明.简便快速提取人肺癌组织线粒体DNA[J].中国肺癌杂志中国肺癌杂志,2005,6(8):186-189.

[10] 夏玉玲,刘彦群,鲁成.动物线粒体DNA提取的原理和方法[J].蚕学通讯,2002,9(22):24-29.

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[14] 王义权,徐珞珊,徐国钧,等.DNA分子遗传标记鉴别在生药鉴定中的应用前景[J].中国中药杂志,1997,22(10):583-586.

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