结核分枝杆菌RD1区研究进展

彭 哲综述,朱朝敏审校

(重庆医科大学附属儿童医院感染消化科 400014)

结核分枝杆菌RD1区研究进展

彭 哲综述,朱朝敏△审校

(重庆医科大学附属儿童医院感染消化科 400014)

分枝杆菌,结核;差别1区;ESX-1

根据WHO的报告,中国是全球结核病高发病国家之一,患者数位居世界第2位,仅次于印度[1]。因此,控制和预防结核病已成为当务之急。1999年Behr等[2]用DNA芯片技术比较了结核分枝杆菌H37Rv,牛结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)3者的全基因组,发现牛结核分枝杆菌基因组与结核分枝杆菌H37Rv相比,有11个差别区(region of difference,RDs),BCG则在牛分枝杆菌的基础上,还多了5个差别区,相对于结核分枝杆菌H37Rv共有129个开放读码框缺失。其中差别1区(region of difference 1,RD1)是惟一的BCG基因组缺失,而且是致病性分枝杆菌存在的区域。RD1区这一独特的遗传缺失区域,不禁让人联想它在结核分枝杆菌(mycobacteriurm tuberculosis,M TB)中的毒力机制和在宿主的免疫反应中所发挥的作用,因此RD1区也成为目前结核研究的热点。

1 RD1区的结构及其编码的蛋白

RD1区基因全长9 455 bp,它包括9个开放读码框(Rv3871～3879c),分别编码9种蛋白。Rv3871蛋白含591个氨基酸,基因生物信息学分析表明在核苷酸的第250～273和1 126～1 149位上具有AAA A TP酶结合结构域,与Rv3870均可能为FtsK-SpoⅢE A TP酶家族成员。Rv3872基因编码PE35蛋白,它与Rv3873编码的PPE68蛋白分别是PE和PPE蛋白家族成员。这两大富含甘氨酸的蛋白家族在基因组中广泛分布,接近编码总量的10%,可能与抗原变异、干扰抗原提呈等过程相关,具有重要的免疫学意义。Rv3874和Rv3875分别编码两个低相对分子质量的分泌蛋白,培养滤液蛋白10(CFP-10)和6 kD早期分泌抗原靶(ESA T-6),它们均是ESA T-6/WXG100家族成员。这两个基因以单拷贝形式分布于M TB中,由同一个启动子调节转录,转录后以紧密的1∶1异二聚体高亲和性形式分泌出细胞壁,是RD1区编码的关键毒力蛋白[3]。Rv3876编码N端富含脯氨酸的蛋白。Rv3877编码膜蛋白,有11个转膜结构域,可以穿过脂质双分子层,提示其可能是跨膜转运的通道。Rv3878编码M TB27.4蛋白,只存在于M TB H37Rv株、Erdman株和牛分枝杆菌中。该蛋白主要位于细胞质,只有少量为分泌蛋白。Rv3879c编码的蛋白包含729个氨基酸,它在分枝杆菌中显示了其基因序列多态性,该蛋白并未发现有跨膜结构和分泌信号。

2 RD1区与ESA T-6分泌系统1类(ESX-1)蛋白质分泌转运途径

Stanley等[4]在筛选RD1区的毒力基因时,发现由RD1区的部分基因及其扩展区构成了一套独特的结核杆菌毒力蛋白分泌系统,其中包括Rv3870、Rv3871、Rv3877 3个组成元件和ESA T-6、CFP-10两个反应底物。将其命名为分枝杆菌分泌系(SNM)独立分泌系统,也被称为ESX-1。在RD1区的基因中, Rv3873和Rv3876并不影响ESA T-6和CFP-10分泌,而且在一些临床分离的M TB毒力株中观察到Rv3878和RV 3879c处于不完整的状态[5],因此认为这4个基因不是ESX-1的组成部分。其后实验发现,为维持ESX-1的分泌功能,除了Stanley等[4]所观察到的外,可能还包括总量不少于14个的组成元件,它们很多位于RD1区外,并且根据不同的分枝杆菌种属有不同的数目[6]。ESX-1怎样将蛋白分泌出极厚的M TB细胞壁,具体过程现在并不清楚,但已知ESA T-6和CFP-10并无经典分泌引导序列或信号肽,因此其分泌表达肯定不依赖于经典的Sec途径。一些实验推测,它们可能是多个蛋白质协同作用来完成分泌的。在它核心组成成分中,Rv3869、Rv3870和Rv3877编码的蛋白,分别有1、3和11个跨膜区域,它们与Rv3871、Rv3868结合在一起,形成一套利用ATP水解供能的膜结合分泌复合物。ESA T-6和CFP-10被分泌前先形成紧密的1∶1异二聚体,当Rv3871识别CFP-l0无序羧基末端的7个氨基酸后,与Rv3870在细胞膜上形成活性A TP酶,同时将信号经Rv3870传递给膜结合分泌复合物,打开通道(Rv3877蛋白),水解A TP后将ESA T-6/CFP-10异二聚体分泌出细胞膜[6]。目前还有很多蛋白只知道是这一分泌过程所必需的,但功能未明。例如Rv3883c编码的类似枯草杆菌溶素的丝氨酸蛋白酶、Rv3872编码的PE35等,需要进一步研究[7]。

Rv3616c-Rv3614c基因区是ESX-1分泌系统的关键调节部位。Rv3616c编码蛋白产物EspA,能被ESX-1系统分泌,它与ESA T-6、CFP-10分泌是互相依赖的,缺少其中任何一个,其余底物的分泌都将失败,而Rv3849编码的EspR能活化Rv3616c-Rv3614c基因启动子,同时EspR自身也能被ESX-1系统分泌。这样便形成了一个负反馈调节圈,使ESX-1系统的分泌处于一个动态平衡的状态[8]。除了EspR外,反应调节蛋白PhoP也是Rv3616c-Rv3614c的调节因子。如果PhoP基因发生点突变,则PhoP不能同该DNA功能结合域结合,从而降低Rv3616c-Rv3614c的表达,最终使ESX-1分泌失效[9]。

ESX-1非常类似于革兰阴性杆菌中经典的Ⅳ型分泌系统。例如:与CFP-10分泌相似,Ⅳ型分泌系统也是通过识别底物非结构化的羧基末端,直接将其分泌出细胞膜的。而且识别单位通常为成对的FtsK-SpoⅢE A TP酶,并具有2个跨膜区和1个胞浆区。而ESX-1分泌系统的Rv3870和Rv3871特征与其吻合。但ESA T-6和CFP-10能存在于体外培养的培养液中,这与革兰阴性菌Ⅳ型分泌机制不同,它们是通过与宿主细胞的相互作用来促进分泌的。因此推测ESX-1并不仅仅是M TB的毒力系统,可能还具有其他生理功能。由于ESX-1由1组独特的蛋白构成,主要的分泌底物都是ESA T-6/WXG100蛋白家族成员,并且蛋白在分泌过程中是相互依存的,只存在于革兰阳性菌中,这使其不同于已知的Ⅰ～Ⅵ型分泌系统,因此将这一新类型的分泌体系称为Ⅶ型分泌系统[6]。

3 RD1区的毒力作用机制

研究发现引入RD1的BCG在动物实验上有与结核毒力株相类似的病理表现,而失去RD1的M TB其致病能力明显减弱[10]。Stanley等[4]发现的ESX-1分泌系统,则合理的解释了RD1的毒力来源。ESX-1对宿主的毒力作用表现在许多方面。实验表明,ESX-1能够诱发肺表面上皮细胞和巨噬细胞溶解,这有助于结核杆菌侵入肺间质,主要机制可能是ESA T-6在宿主细胞膜表面形成通道,致死性的离子流最终导致细胞溶解坏死[11]。还有实验认为ESX-1分泌的CFP-10/ESA T-6复合物起分子信号的作用。它们通过与宿主细胞表面特异性受体结合以调节宿主细胞的行为[12]。Davis和Ramokrishnan[13]通过对感染斑马鱼的海分枝杆菌的研究发现也支持这一点,在早期感染阶段,ESX-1的一个或多个的成分使感染的巨噬细胞分泌聚集信号,诱导未感染的巨噬细胞聚集,并吞噬新形成的肉芽肿,导致结核杆菌快速增长和扩散,而ESX-1缺失的海分枝杆菌在巨噬细胞间的扩散明显减弱。如果巨噬细胞内的吞噬溶酶体吞噬了M TB,它分泌的CFP-10/ESA T-6复合物则在溶酶体内酸性条件下解离,ESA T-6将结合到脂质体上并导致其溶解,M TB从而逃入细胞质而避免被杀死[14]。ESX-1其他的致病性效应还包括抑制巨噬细胞的信号传递,以此阻碍促炎症细胞因子的产生等[4]。以上研究表明,RD1区编码的ESX-1对M TB的致病性发挥了重要作用。

4 RD1区编码蛋白的免疫原性

随着MTB的许多T细胞抗原被鉴定,令人惊讶的是在RD1区的9个基因中,除Rv3876、Rv3877外,其余基因编码的蛋白都具有T细胞抗原决定簇,这可能形成了一个免疫原性岛。但不同的抗原诱发T细胞反应的能力并不一样,Brusasca等[15]将Rv3871～Rv3875、Rv3878编码的6种蛋白测试感染结核豚鼠的迟发型超敏反应(DTH),发现只有CFP-10和EAST-6有明显的DTH反应,而Rv3873(PPE68)仅引出2～4 mm的低水平反应,其余则为阴性。同时测试肺结核患者的血清抗体阳性率,也是以EAST-6和CFP-10最高。另外, Rv3873(PPE68蛋白)在健康对照组中有阳性反应,考虑是受到广泛分布在分枝杆菌中PPE家族的交叉反应的干扰所致。Caroline等[16]也发现Rv3872(PE35)、Rv3878、Rv3879c不能诱导C57BL/6小鼠体内出现明显的γ干扰素(IFN-γ)。目前还没有证据表明伴侣蛋白Rv3876、膜蛋白Rv3877具有抗原性。

5 RD1区的相关应用进展

5.1 在疫苗方面 BCG是现在预防结核病的惟一菌苗,但它在不同地区的保护效果差异显著,一些学者认为BCG在传代过程中过度减毒降低了其保护力,后有人将RD1片断引入BCG,证实其产生的免疫保护力超过了未重组的BCG,这为研究者提供了新的思路,即适当恢复BCG的毒力有助于提高疫苗的保护力[17]。在进一步研究RD1区编码的蛋白时又发现ESA T-6和CFP-10都是诱导IFN-γ分泌的优势抗原,而IFN-γ可显著活化巨噬细胞,提高对胞内结核菌生长的抑制作用和杀伤能力,并且ESA T-6是记忆性CD4+T淋巴细胞的靶分子,能诱导持续的免疫力[18]。但实验显示,只有具备完整ESX-1分泌系统的重组BCG才能诱发EAST-6特异性的T细胞反应,否则,即使重组BCG细胞质内具有EAST-6,如不能分泌,也不能诱发相应的T细胞反应[7]。提示疫苗具有有效的抗原分泌是产生免疫保护作用的关键之一。M TB的许多分泌蛋白都是重要的保护性抗原,通过对ESX-1分泌机制的研究,也许将对制备新型疫苗有重要帮助。目前丹麦哥本哈根血清研究所研发的结核菌Ag85B-ESA T-6融合蛋白疫苗正在进入临床实验,期望在不久将来可以得到更多高效安全的新疫苗。

5.2 在诊断方面 RD1区编码的蛋白中PE35、PPE68、RV 3878、RV 3879c都具有用于血清学诊断抗原的潜力,但它们的特异性或敏感性均较CFP-10和ESA T-6差。实验表明当ESA T-6和CFP-10联合使用检测M TB感染时,其敏感性和特异性均明显高于结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)[19]。它们不仅可将人或牛M TB感染、BCG接种和环境中的非致病性分枝杆菌区别开,而且还可将由于BCG接种和接触非致病性分枝杆菌所造成的PPD假阳性区分开。由于增殖期和非复制期的M TB在细胞内生长期间都高度表达ESA T-6。因此,无论是在活动性结核病还是在感染潜伏期,ESA T-6均可诱导细胞免疫反应,这也为诊断潜伏结核感染提供了重要的手段。尤其重要的是,它们对H IV感染的潜伏结核病患者也有较高的敏感性和特异性,这有助于尽早对这些患者使用抗结核预防治疗[20]。现国际上已有将ESA T-6和CFP-10作为诊断抗原的IFN-γ体外释放检测商品试剂盒供应,如Quanti-FERON-TBGOLD(Cellestis L td.,Carnegie,Victoria,Australia)与T-SPOT.TB test(Oxford Immunotec,Abingdon,UK)等。FDA已批准将该方法用于结核病潜伏感染的检测。以上实验及检测方法为结核病的诊断提供了重要的临床和试验价值,值得进一步深入研究。

综上所述,目前对RD1区的研究和应用都已取得了长足的进展,但仍不清楚ESX-1的具体分泌机制,ESA T-6和CFP-10作为毒力蛋白,如何作用于细胞表面及细胞内成分也尚未完全阐明,而且在M TB中还有与ESX-1同源的其他4个ESX分泌系统,它们之间的关系及各自的生理功能也需要进一步研究,如果能够解释这些难题,将可能帮助找到新的结核药物的靶向位点,以及获得更加安全有效的新疫苗。

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2010-02-06

2010-05-19)

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.01.042

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1671-8348(2011)01-0089-03

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