HGF在治疗缺血性疾病中的应用

陈 磊,杨 植

（承德医学院附属医院普外二科，河北承德 067000）

HGF在治疗缺血性疾病中的应用

陈 磊,杨 植

（承德医学院附属医院普外二科，河北承德 067000）

肝细胞生长因子；缺血性疾病；肿瘤

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF）最初作为肝细胞有丝分裂原被提纯和克隆[1]，它在各种细胞中有促有丝分裂、运动形成、形态发生及抗凋亡等作用[2]。HGF的多种作用是通过由细胞膜上c-met前癌基因编码的酪氨酸激酶受体介导的[3]。在生理上，HGF作为亲器官因子发挥作用，它对器官(包括肝、肾、心脏、肺）有保护和修复作用。更重要的是HGF有促进血管新生的作用，HGF可以血管内皮细胞生成而不会引起血管平滑肌细胞的增生。

缺血性疾病(如冠状动脉阻塞性疾病、周围动脉闭塞性疾病、脑梗塞等）由于血管的狭窄阻塞或先天性异常，导致其供应器官或组织的缺血、缺氧甚至萎缩坏死。随着血管重建术和介入手术的开展，许多患者的病情得到了控制，但是由于病变血管的解剖关系及其分布使一部分手术难以实施，患者病情恶化。因此，新的治疗措施亟待发现。Folkman提出了应用血管新生疗法治疗动脉缺血。血管新生疗法即通过应用血管生长因子或其基因，促进缺血组织的血管新生和侧支血管形成，使缺血得到改善的新的治疗方法。各种内皮细胞生长因子在血管新生过程中起着很重要的作用。目前研究较多的有血管内皮生长因子(VEGF）、肝细胞生长引(HGF）和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF）等。HGF能有效地促进血管的新生和抑制细胞凋亡，且不引起组织水肿等副作用，成为基因治疗的理想选择。而且实验研究发现，分别在患有动脉硬化闭塞(ASO）的患者(不伴有冠心病、充血性心衰、心律失常及肝、肾、肺功能障碍）的病变部位及非病变部位取材，测量血管HGF的浓度，病变部位HGF的浓度显著降低，因为HGF有促进血管内皮细胞生成及促有丝分裂的作用，所以血管HGF系统下调可能与周围血管疾病发病机制有关。ASO患者病灶处血管HGF生成减少可能由于缺氧引起，缺氧在体内和体外都对HGF有较强的抑制作用。HGF属于Kringle蛋白家族成员，可以介导蛋白与蛋白之间、蛋白与细胞之间的相互作用，有控制血栓形成的作用。局部HGF生成减少可以造成微循环紊乱[4]。由此可见，局部组织的缺血、缺氧可以抑制HGF的产生，而HGF生成减少又可以引起局部微循环紊乱，加重局部的缺氧，形成恶性循环。HGF的补充治疗方法不仅可以促进侧支血管的生成，增加组织灌注，而且可以打断恶性循环过程，达到治疗的目的。近来，有关HGF治疗各种缺血性疾病的动物实验在国内外广泛开展，某些地区已进入临床实验阶段，而且取得了较好的短期效果。

1 HGF作用

1.1 促进侧支血管的新生 血管形成主要分为两种类型：一种是在胚胎期，由血管母细胞通过原位分化增值形成初步的血管网络结构，即血管发生；另一种称为血管新生，首先发生血管扩张及通透性增加，然后经血管基底膜酶解，血管内皮细胞活化、增殖、迁移、血管腔形成，平滑肌细胞的作用等多个步骤有序协调地完成，最后形成新生血管网[5]。HGF的受体是由前癌基c-met编码，受体c-Met主要存在于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的细胞膜上，HGF本身可以刺激受体c-Met水平上调，激活自分泌反馈环路[6]，且其促血管内皮细胞有丝分裂的活性是生长因子中最强的[7]。HGF上调受体c-Met后通过一系列信号转导，使血管内皮细胞生成和迁移及血管平滑肌细胞迁移，从而促进侧支血管新生。组织缺血可以为HGF发挥上调受体c-Met创造有利环境。HGF还可以通过刺激血管内皮细胞分泌VEGF间接引起血管内皮细胞的生成，发挥侧支血管新生的作用。此外，HGF 还可以通过PI3K/Akt途径和MAPK途径磷酸化eNOs(内皮细胞一氧化氮合酶），这两条途径可以相互影响，从而有效促使NO生成迅速增多，NO为内皮细胞来源的血管舒张因子，也参与了血管新生过程[8]。

1.2 抗凋亡的作用 HGF阻断细胞凋亡是通过MAPK途径[9]和磷脂酰肌醇三激酶/Akt途径[10]，并能使Bcl-2和BclxL水平上调，Bcl-2和Bcl-xL均有抑制凋亡的作用，从而发挥对神经、心肌、骨骼肌的保护作用。

1.3 神经保护作用 HGF作为胚胎运动神经的存活因素发挥作用，而且可以促进交感神经、副交感神经及其前体的分化及轴突长出，增强其存活能力[11]。HGF的多种功能及其与其它嗜神经因子的协同作用说明，HGF能增强发育中的神经元对各种特殊信号的反应能力。此外，在脑缺血模型中，可以增加侧支血管的生成及抗凋亡作用，也有保护神经的作用。正常情况下，HGF的神经保护作用很有限，因为血脑屏障的存在，中枢神经系统很难受到循环中的蛋白和肽的影响，为了克服这种限制，我们可以将HGF基因注入蛛网膜下腔，实验发现HGF基因广泛转染入脑膜及血管外膜细胞，而没有转染入除脑以外的其它器官。转染后，在脑脊液中发现HGF蛋白[17]。

1.4 促有丝分裂作用[2]HGF通过由细胞膜上c-met前癌基因编码的酪氨酸激酶受体介导[4]。HGF还可以刺激体内骨骼肌的再生，防止肌萎缩和肌纤维化，促进胚胎器管生成，以及促进由于多种损伤引起的组织、器官的修复等多种功能。有研究报道，术前注射HGF质粒可以使肝硬化大鼠部分肝脏切除后存活率明显升高[18]。

2 HGF制剂

现在实验所用HGF大体上分为两种，一种是含有重组HGF蛋白，另一种是含有HGF基因。HGF基因疗法要优于重组HGF蛋白，HGF基因转染一大优点是它可以在局部持续表达HGF蛋白。应用重组HGF蛋白需要将大量的肽注入体内，可能对身体其它器官带来副作用，此外，还需特殊仪器重复多次给药，以维持局部较高的HGF浓度；而HGF基因转染则可在需要的时间内表达HGF蛋白，无需多次给药。实验研究发现，在小鼠后肢缺血模型中，经肌肉注射裸HGF质粒DNA5周后，血管新生的程度明显高于经动脉给重组HGF蛋白所引起的血管生成程度[22]。因此，近来HGF基因疗法为更理想的选择。

HGF基因制剂所用载体大体分为病毒载体和非病毒载体。（1）病毒载体：腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒等。缺点：靶向特异性差、可控性小、免疫原性高度、毒性大、安全性低、目的基因容量小。（2）非病毒载体：包括裸DNA、脂质载体和阳离子多聚体等。缺点：基因转染率低、表达持续时间短且表达量不高，大剂量使用时有细胞毒性。

3 给药途径

在不同的缺血性疾病中，给药途径不同，同一种疾病可以有多种给药途径。

3.1 心肌缺血 在急性的心肌缺血时，HGF基因及其载体的引入可以通过开放手术或经皮导管介入方法，经心肌注射在开放手术及经皮介入术中均较易实施。注射区域可以通过在开放手术中直视或在经皮导管介入术时评价无收缩功能的心肌区域来确定。

3.2 脑缺血 基于HGF基因及其载体很难通过血脑屏障，一般采取鞘内注射，将HGF基因及其载体注入蛛网膜下腔。

3.3 周围血管疾病 现多采用经缺血部位的骨骼肌注射，也可以经动脉或静脉注射，如股动脉闭塞时，可以经髂内动脉给药。

4 检测方法

HGF的促使侧支血管的新生和抑制细胞凋亡成为人们关注的焦点，被广泛应用于缺血性疾病的治疗。在实验研究中，对HGF、HGF受体及其这两方面的作用常用的检测方法如下。

4.1 对HGF及其受体的检测 可采用Western Blotting、酶联免疫吸附实验(ELISA）及免疫组化染色，利用HGF蛋白及c-Met蛋白的抗体都可以测定HGF及其受体的表达情况，还可通过定量的反转录聚合酶链反应测定HGFmRNA，间接评定HGF的表达情况。

4.2 对HGF促血管生成作用的检测 （1）微血管造影术；（2）激光多普勒血流分析；（3）在心肌缺血实验时，可以采用微滴分析；（4）采用免疫组化染色的方法，主要是利用血管内皮细胞特异性标记Von Willebrand’s Factor或第Ⅷ因子的单克隆抗体测定。以此来测定血管内皮细胞数。

4.3 对HGF抗凋亡作用的检测 可采用TUNEL(Terminal dUTP nick end-labeling）分析来测定凋亡细胞百分比。也可以通过Western Blotting)用Bcl-2和Bcl-xL多克隆抗体测定)，HGF可以使Bcl-2和Bcl-xL水平上调，而Bcl-2和Bcl-xL均有抑制凋亡的作用。

5 HGF与VEGF的区别

VEGF(血管内皮生长因子）作为血管渗透因子和血管内皮细胞有丝分裂原被大家所熟知，VEGF血管内皮细胞特异性已经被认为在治疗性的血管新生中发挥着重要作用，作为内皮细胞重要的细胞元素负责新血管的生成。而且HGF为分泌型蛋白，有信号肽序列，即使基因转移的效率较低也可以发挥明显的生物学效应。试验和临床都已证实VEGF有促进血管新生的作用，效果令人满意。

HGF与VEGF同是血管生长因子，但有所不同：（1）VEGF基因治疗缺血性疾病(如脑缺血、下肢动脉缺血）可以引起组织水肿，而HGF基因治疗则无此副作用。可能由于血管平滑肌细胞上存在着受体c-Met，HGF能引起血管平滑细胞的迁移而不引起其增生；而血管平滑肌上缺乏VEGF受体，VEGF既不能引起平滑肌细胞的迁移，也不能引起其增殖，致使新生的血管延期成熟。与此相反，HGF能引起血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的迁移，新生血管较早成熟，因而避免血管内的物质渗漏。（2）在人动脉内皮细胞中，HGF较VEGF有较强的促有丝分裂的作用[12]。（3）HGF基因及其受体c-met大量存在于心脏和血管内皮细胞上，所以，我们推测HGF较VEGF有更强的促血管新生的作用。（4）HGF还可以通过PI3K/Akt途径和MAPK途径磷酸化eNOs(内皮细胞一氧化氮合酶），这两条途径可以相互影响，HGF能更有效促使NO生成及eNos的磷酸化[7]，NO有较强的扩血管作用，也参与了血管新生过程，因此，HGF更能增加缺血组织的灌注。（5）HGF可以提高细胞相关基质降解酶(MMP-1等）水平，并能提高机体生成血纤维蛋白溶酶(uPA）能力[13]。HGF在局部诱导uPA数量增多，uPA能有效地给靶细胞提供HGF，为组织微环境创造良好条件。

已有报道，在心肌缺血模型中，低氧可以使受体c-met水平上调，从而增强了HGF的促血管生成效应。

6 HGF与肿瘤的关系

到目前为止，应用HGF基因疗法没有记载过新生血管的任何结构和功能的异常，实验动物组织器官的瘤样改变，以及在治疗过程中其它的副作用，但是肺癌患者受体c-Met和HGF基因有异常表达[14]。HGF可以提高癌细胞(包括肺癌细胞）的侵袭能力[15]及促血管生成作用，可能加速病人潜在恶性病灶的生长和加速糖尿病病人的视力恶化等，因此，HGF的过度表达是否会促进肿瘤生长引起大家的关注。实验研究发现：先在小鼠皮内接种A431使其背部长有上皮来源的肿瘤，这种肿瘤细胞上表达受体c-Met，然后将HGF质粒DNA注入大腿部的肌肉内，观察到的结果是只有大腿肌肉内的HGF的浓度增高，而在血液中的HGF浓度没有增高。虽然在体外HGF可以刺激A431细胞生长，但在小鼠后肢暂时局部的HGF升高对肿瘤生长毫无影响[16]。

7 临床应用

7.1 脑缺血 由于脑动脉粥样硬化及Moyamoya病造成脑梗塞常常会引起大脑半球的缺血，并伴有神经病理学的改变(如痴呆）。缺血可以代偿性地引起病灶部位血管生成，尤其是在缺血半暗带，然而，血管新生的自然过程不足以缓解缺血组织的低灌注，虽然许多血管生长因子(如成纤维细胞生长因子、HGF、VEGF等）都有促进侧支血管生成的作用，但是神经元对缺血缺氧极其敏感，单纯刺激侧支血管新生不足以治疗脑缺血，位于海马CA1区的锥形神经元对脑缺血最为敏感，一过性阻断沙鼠单侧颈动脉血流，其在恢复循环的几天后开始死亡，因此，防止神经元延期死亡有一定治疗意义。考虑到脑缺血损伤的各个方面，其理想的治疗方法应该既可以增加侧支血管形成，又可以防止神经细胞的死亡。HGF既可以促进血管新生，又有神经保护作用。实验研究表明，在鼠脑缺血模型中，将含有HGF基因的HVJ包被的脂质体注入蛛网膜下腔，24小时后，与对照组相比，脑组织坏死面积显著减少，梗塞部位及未损伤部位毛细血管密度均显著增多，并且没有脑水肿及血脑屏障的破坏[17]。因此，HGF基因治疗可能成为脑缺血治疗的新方法。

7.2 心肌缺血 冠状动脉的狭窄、闭塞可以引起其供应心肌的缺血，甚至坏死。我们已经注意到心肌梗塞的患者血浆HGF水平增高，可能是对缺血部位持续低灌注的保护性反应，而病灶部位HGF的水平却下降，可能是反应不良。在病灶部位增加HGF的分泌可以减小心室的扩张程度，增加缺血心肌的灌注[19]。实验研究结扎鼠的冠状动脉左前降支，分别经左室游离壁心肌注射Adeno-HGF和Adeno-Null，免疫吸附实验发现，在注射6周后，85%的左室游离壁心肌有大量HGF蛋白表达；血液动力学发现，与Adeno-Null组相比，Adeno-HGF组心肌收缩功能显著增强；在形态学上，Adeno-HGF组的左室形态改变较小，左室扩张程度明显降低，变薄的左室游离壁心肌范围也明显缩小。近来，还有学者报道，转染HGF基因能够减缓压力超负荷所致的大鼠左室增大及心肌纤维化，提示HGF具有抗心肌重塑作用[20]。与此同时，Adeno-HGF 治疗组毛细血管密度也明显高于对照组，而凋亡细胞百分比却明显下降，Bcl-2和Bcl-xL水平上调[19]。HGF对心肌功能的保护作用可能是通过其促血管新生和抗凋亡两方面作用实现的，缺血部位的心肌细胞可能会由于持续发展的供血不足而死亡或失去功能，而在缺血区域血管的新生，可以挽救大部分可能丢失的心肌。实验研究已经证实，心肌缺血后的再灌注有利于心室的重塑和心肌功能的改善[21]，心肌梗死后早期，缺血部位很多心肌细胞虽然可以见到，但由于缺血处于低功能或无动能状态，早期促使血管生成是非常有效的。心肌梗死后心室的重塑(包括心室的扩张和室壁的变薄）是一个必然的过程，而心室重塑过程多伴随着心肌细胞的死亡，HGF能有效地抑制细胞的死亡， 特别是抑制凋亡细胞的死亡，在减弱心肌缺血后的损伤中发挥着重要作用。HGF治疗组Bcl-2和Bcl-xL水平上调，Bcl-2和Bcl-xL均有抗凋亡作用。心肌缺血损伤后，HGF的抗凋亡作用可以抑制细胞的死亡和心室重构，以及保护心肌功能。由于在急性的心肌梗死时转染HGF基因，HGF基因不会立刻表达，所以，与心脏的介入治疗结合，对急性的心肌梗死效果更佳。国外研究发现，猪冠状动脉结扎模型局部HGF浓度低下，通过HGF基因导入补充治疗，可诱导明显的血管新生，此时内皮细胞增加达8倍，通过HGF引起的血流增加50%[23]。

7.3 周围血管疾病 局部HGF浓度下降，可能与周围血管疾病发病机制有关。应用血管生长因子促进侧支血管的生成治疗周围血管疾病已广泛报道，并取得了较好的短期临床效果。随着人口老龄化，临界性或重症肢体缺血(CLI）的发病率逐年上升，其中一部分人由于解剖关系或闭塞血管的分布不能通过血管重建或介入方法治疗，致使病情恶化，有较强的致残率。近来，采用干细胞移植取得了一定的效果，但干细胞的提取、纯化较困难，而且存在着不稳定因素。因此，新的治疗措施亟待发现。实验研究发现，分离切除兔股动脉及其分支10天后，分别经骨骼肌注射裸HGF质粒DNA及空质粒，30天后，与对照组相比，HGF基因治疗组缺血部位侧支血管明显增加，并伴有HGF蛋白的表达，激光多普勒血流分析显示缺血部位血流、缺血部位血压与正常部位血压之比均显著增加[24]。因此，HGF基因治疗给许多CLI患者带来了新的希望。

此外，HGF基因还被引入到了严重的肺血管减少性疾病[25]及肾缺血[26]等的治疗中，动物实验都取得了较好的效果。虽然如此，我们也应该意识到我们对HGF促血管生成及抗调亡等作用的机理了解得十分有限，在诸多方面还有不同见解，但是，HGF基因治疗给临床治疗缺血性疾病提供了新的方法，只要进一步提高HGF基因的纯化和导向技术，改善基因载体的转然效率，提高基因表达信号传导的可控性，HGF基因一定能为缺血性疾病患者带来福音。

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