晚期糖基化终末产物及受体在实验性2型糖尿病大鼠种植体周围的变化及表达

穆 郑 李 琳 朱正宏 刘海鑫 李 婷

南京同仁医院口腔科，江苏 南京 211100

糖尿病是一种遗传、免疫功能紊乱、微生物感染等常见的内分泌系统代谢紊乱综合征[1]。随着经济的发展、食物种类的变化、现代人的生活方式，糖尿病的发病率日趋增加，有资料表明[2]，遗传、肥胖、年龄与2型糖尿病的发病有着密切的联系。其中有一半的2型糖尿患者多在55岁以后发病，在这些患者中有不少的患者会有各种不同的牙齿问题，在其他一些修复方法不适合的情况下，牙种植技术成为他们最好的选择。但已有研究证实[2]，骨组织中AGEs和RAGE相互作用是糖尿病骨质疏松的重要致病机制之一，因此糖尿病患者往往同时伴有骨质疏松症。而骨整合是口腔种植的生物学基础，种植体-骨界面的骨整合情况受多种因素的影响，但最主要的基础因素是界面骨的骨结合率，钙化成熟度，它们决定着界面的结合强度与种植体的最终稳定性。但据王瑞良等[3]研究结果显示，即使在血糖得到良好的控制时，糖尿病患者的牙种植成功率仍然比较低。亦有动物实验研究结果显示，建立DM模型动物后，种植体植入体观察一段时间后发现，种植体的骨整合率有显著的下降[4]。然而DM对种植体骨整合的影响是比较复杂的过程，需进一步研究。因此本研究是在建立大鼠2型DM模型的基础上，比较正常组与DM大鼠胫骨植入种植体后血清中AGEs的变化及种植体周围骨组织中RAGE的表达变化，探讨骨组织中AGEs和RAGE相互作用是使2型糖尿病影响种植体骨结合的机制之一。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与材料 链脲佐菌素（streptozotocin STZ，上海艾研生物科技有限公司），柠檬酸溶液，4%戊巴比妥钠（南京同仁医院麻醉科提供）。种植机及纯钛种植体，1.3 mm×7 mm（江苏生物有限公司）。

1.1.2 动物 3月龄SD健康雄性大鼠45只，体重160～220 g（购于江苏省疾病研究所）。

1.1.3 实验仪器 ACCU-CHEK血糖仪（德国罗氏公司）；岛津荧光分光光度计（RF-5301PC型）；抗RAGE单克隆抗体（上海研生生化试剂有限公司）；JJQ-P2016A生物组织切片机（武汉俊杰生物科技公司）；奥林巴斯UIS2显微镜。

1.2 方法

1.2.1 2型DM大鼠模型的建立 所有的实验大鼠均适应性喂养2周，禁食12 h，随机分为DM模型组25只（防止中途死亡和建模失败）和正常对照组20只，先喂以高脂高果糖饲料4周，饮水为自来水，4周后小剂量链脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）腹腔注射1次，2周后诱导建立2型糖尿病模型，尾静脉采血检测血糖值，血糖高于11.1 mmol/L视为建模成功[3]，不符合者剔除。正常组则注射等量枸橼酸钠溶液。DM模型组中22只血糖达到预期标准，剩余3只未达到上述标准被淘汰。在饲养过程中因血糖过高，模型组大鼠死亡2只。将剩余20只建模成功的大鼠随机分为DM组和DM种植组，每组10只。将20只正常组大鼠随机分为正常对照组和正常种植组，每组10只。

1.2.2 植入种植体 手术区按常规手术备皮消毒，腹腔注射4%戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）麻醉种植组大鼠，麻醉后于术区切开、剥离、露出骨面后定位，在生理盐水冷却下制备种植体窝，植入种植体，检验初期稳定性，创口对位缝合，术后给予青霉素粉剂预防感染。待实验大鼠苏醒后继续给予常规喂养，并检测DM组大鼠血糖，必要时按注射计量再注射1次，使其维持在实验模型范围内。

1.2.3 采集样品 10周后测量血糖，再次称体重，然后在禁食12 h后下腔静脉采血后处死大鼠。种植组大鼠，于术区取下种植体，切取种植体及周围骨组织；非种植组大鼠，切取左侧胫骨近骺端约1 cm范围内骨组织，剔除包括骨膜在内的所有软组织，所取标本于10%中性缓冲福尔马林液固定，EDTA脱钙，乙醇中按顺序逐级脱水，种植组平行于种植体连续石蜡切片，取种植体周围4 mm的骨组织进行4μm切片行HE染色。

1.2.4 指标检测及方法 用RF-5301PC型荧光分光光度计测定血清中AGEs的含量。骨组织RAGE表达变化，按上海研生生化试剂有限公司提供的RAGE免疫组化染色试剂盒说明书操作，所做标本在显微镜下观察结果。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 种植体的愈合

种植组创口愈合良好，无感染，软组织无红肿、破溃。糖尿病种植组种植体部分二维方向上有0.5 cm的松动，其余种植体稳定性良好，无移位。

2.2 种植术后10周各组大鼠血清中血糖、AGEs和体重的变化

DM组和DM种植组血清中AGEs含量明显增加，与其他两组比价差异有统计学意义（P＜0.05）。四组间血糖及体重的变化，差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 血清中AGEs、血糖、体重的变化（）

表1 血清中AGEs、血糖、体重的变化（）

组别 n AGEs（AUPmg 蛋白） 血糖（mmol/L） 体重（g）正常对照组 10 0.0274000±0.0031283 6.12±2.43 512.00±36.74 DM组 10 0.2010000±0.0008723 22.26±3.18 245.00±42.54正常种植组 10 0.0378000±0.0019083 6.78±3.74 478.70±52.49 DM种植组 100.2121000 ±0.0004283 24.21±2..64 217.00±36.68 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 各组大鼠种植体周围骨组织中RAGE结果分析

RAGE蛋白表达定位于骨细胞中。DM种植组（图1-A）大鼠种植体周围骨组织RAGE蛋白表达呈棕黄色至深棕色，分布较广泛。DM组（图1-B）亦出现RAGE蛋白的阳性表达，但其染色比较淡、呈淡棕色、分布散在。正常种植组（图1-C）虽然RAGE也有零散的分布，但是其阳性表达率较DM种植组和正常种植组低，染色隐约显示呈淡棕色，正常对照组（图1-D）的骨组织RAGE蛋白阳性表达是四组中最低的。

图1 4组大鼠胫骨在400倍光镜下RAGE免疫组化表达

2.4 RAGE阳性细胞率的结果分析

DM种植组RAGE细胞阳性率是四组中最高，与其他各组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；DM组与其他各组比较亦较高，但低于DM种植组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常种植组和正常对照组比较，差值较小，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 种植术后10周骨组织RAGE阳性细胞率的比较（）

表2 种植术后10周骨组织RAGE阳性细胞率的比较（）

组别 n 百分比 F P正常对照组 10 0.25±0.65＜0.05正常种植组 10 0.33±0.55 13.245 DM 10 1.237±0.15 DM种植组 10 1.66±0.67

3 讨论

近年来随着口腔种植学不断的发展完善，口腔种植修复是否成功的3个基本内容[5-6]，从患者来讲主要考虑对美学，功能方面。从医生角度来讲主要考虑种植体与骨结合的长期稳定性。然而，由于DM患者的一系列病理变化，一方面，患者的抵抗力随着血糖的升高及一些并发症的发生而下降，影响了伤口的愈合；另一方面，DM患者同时存在骨代谢及磷、钙代谢的紊乱，继而会引发骨质疏松，从而使种植体的稳定性及其功能受到影响，因此较高的失败率和较差的初期骨结合使糖尿病患者的种植修复成功率有所下降。

AGEs的形成又被称为非酶促糖基化反应[8]，是指体内可还原酶（葡萄糖）与蛋白质氨基酸的游离氨基端的亲核添加聚合过程，亦可称之为添加反应。它主要有两个阶段，一个是可逆阶段，一个是不可逆阶段。不可逆阶段经过复杂的重组后最终形成不可逆的AGEs[9]。Reddy等[10]证实AGEs可与其受体结合，诱导人间充质干细胞凋亡并阻止同源分化脂肪、软骨、骨。AGEs也可通过促进单核/巨噬细胞产生白细胞介素（IL）-1、肿瘤坏死因子β等细胞因子，提高破骨细胞活性，加速骨吸收，从而参与了骨质疏松的发病。糖基化终末产物受体（RAGE）是目前已经确定的与AGEs结合的主要受体是[10]。AGEs通过与其受体RAGE结合蛋白相互作用，干扰骨重建过程，导致糖尿病骨代谢紊乱的发生发展。许多研究显示RAGE参与了糖尿病骨质疏松的发生与发展过程。Santana等[11]研究表明，AGEs与RAGE相互作用是主要的致病途径之一。有研究表明在糖尿病动物的颅盖骨组织中RAGE的表达上调，应用RAGE的配体可以导致骨形成抑制，并且证明剂量与抑制作用成正比[12]。而本实验研究结果显示，DM组和DM种植组血清中AGEs的含量与其他组比较明显升高，相对应免疫组化结果亦显示RAGE的表达成阳性，AGEs和RAGE的相互作用使种植体的愈合没有达到完全稳定性，因此在实验结果检测种植体愈合情况时发现有部分糖尿病组种植体愈合在二维上有0.5 cm范围的松动，进一步说明DM组种植体没有达到骨整合。

AGEs还可以增加骨的吸收[13]。单核巨噬细胞细胞膜上存在着AGEs受体，而AGEs修饰的蛋白对其具有趋化作用。AGEs在受体介导下与单核巨噬细胞结合，会释放多种细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1等[11-12]。这些细胞因子不仅增加其骨吸收活性，而且通过一些途径促进破骨细胞前体细胞转化为成熟的破骨细胞[13]。因此，AGEs的升高不仅使骨形成作用相对降低，而且使骨吸收也相对增加，从而导致骨量的丢失。而种植体的愈合基础要达到骨整合，就需要一定的骨量支持，而骨量的丢失会影响到种植体的初期稳定性，从而影响其最终的使用功能。本研究发现糖尿病大鼠血清中AGEs明显升高，但是在做标本切片时发现其骨密度则有所降低，因而推测，糖尿病状态下的的大鼠其AGEs升高可能是导致种植体愈合不良的原因之一。

总之，糖尿病特别是2型糖尿病对种植体骨愈合的影响已被广泛的接受，其影响因素也做了多方面的推测，但其机制目前有多种说法，没有达成共识。本实验也只是通过建立糖尿病大鼠模型，检测血清中AGEs含量的变化和从免疫组化的方法分析RAGE的表达来探讨其机制，结果检测到2型DM大鼠血清中AGEs明显升高，种植体愈合差，没有达到骨整合。并且从免疫组化的结果来看，2型DM大鼠种植体周围骨组织RAGE蛋白表达呈棕染色，明显高于对照组。以此笔者推测，种植体骨组织中AGEs和RAGE相互作用是影响2型DM种植体骨结合的机制之一。

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