饲粮结构对山羊消化系统尿素转运蛋白 -B表达的影响

杜建文 孙海洲＊ 赵存发 李胜利 宋丽霞

尿素是动物机体蛋白质代谢的主要终产物,它一直被认为是以脂质扩散的形式进行跨膜运动的。然而,随着研究的深入,人们发现在红细胞和肾集合管末段对尿素的通透率远高于简单脂质扩散,于是广大研究者推断存在一种控制尿素转运的载体——尿素转运蛋白 (urea transporter,UT)[1-3],随后证明尿素跨膜转运是由载体蛋白调控的[4]。1993年,You等[5]首次从兔肾脏内髓质层分离得到尿素转运蛋白 -A2(UT-A2)的cDNA,为研究 UT奠定了基础,从而也对传统的尿素转运机制提出了挑战。随后,Olives等[6]从人骨髓中分离出了另一个 UT家族成员——尿素转运蛋白 -B(UT-B)的 cDNA。随着研究的深入,人们已从大量的动物中发现了 UT的存在,尤其是山羊消化系统、肝脏和唾液腺[7],牛瘤胃[8-9]以及绵羊消化系统[10]。众所周知,反刍动物饲粮氮的利用率很低,一般认为其通过大量的内源氮循环(其中大部分以尿素的形式进行循环)来提高氮的利用。研究发现,饲粮可以调控内源氮循环[7-10],而已有研究表明 UT对尿素循环起着极其重要的作用[1-5]。本研究拟通过蛋白质印迹(Western Blot)来测定饲粮中玉米的加工方式和蛋白质水平对内蒙古白绒山羊消化系统 UT-B的相对表达量,旨在研究饲粮结构对山羊消化系统 UT-B表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选用 18只体况良好、平均体重为(34.95±2.37)kg的装有永久性瘤胃瘘管的内蒙古白绒山羊半同胞羯羊,随机分为 6组,每组 3个重复,每个重复 1只,单栏饲养。

1.2 试验饲粮和试验设计

试验饲粮参照 NRC(2007)山羊营养需求配制。试验用玉米分为破碎(C)和膨化(E)2种,试验饲粮蛋白质含量分为低(L)、中(M)、高(H)3个水平。6组试验饲粮分别为破碎玉米低蛋白质(CL)组、破碎玉米中蛋白质(CM)组、破碎玉米高蛋白质(CH)组、膨化玉米低蛋白质(EL)组、膨化玉米中蛋白质(EM)组和膨化玉米高蛋白质(EH)组。CM组为对照组,代谢能为维持代谢能的 1.4倍。试验饲粮组成及营养水平见表 1。

试验羊每天分别在 06:30和 18:30先粗后精等量饲喂,自由饮水,饲喂 45 d后每组选取 1只屠宰采样。

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 样品采集

试验羊宰前禁食 24 h,禁水 12 h,取腮腺、瘤胃背囊和腹囊、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠(近端)、回肠、盲肠盲囊和盲肠(回盲结合部后 30 cm处)、肝脏、肾脏,用冷生理盐水冲洗。瘤胃黏液层要从肌层剥离,肠道要把浆膜和肌膜从黏膜上剥离,样品进行编号(表 2)后 -80℃保存待测。

表2 各组试验羊样品编号Table 2 The number of the samples in various organs of the goats in each group

1.4 兔抗羊多克隆抗体的制备和样品中 UT-B的测定

多克隆抗体制备参照 Ludden等[10]的方法,免疫用多肽序列为:CEENRIFYLQSTKRTV,根据Smith等[11]描述的山羊 UT-B的 ACP18881序列合成的。

蛋白质印迹检测各样品中 UT-B的表达情况,然后将 CL组试验羊的腮腺目的蛋白(34 ku)条带的灰度值定义为基础值(1.000),计算各组织的目的蛋白(34 ku)的相对表达量(目的蛋白条带的灰度值 /基础值)。

1.5 数据处理

所有数据用 Excel软件进行整理。

2 结 果

图1是所有被测样品中 UT-B的免疫印迹图,各试验羊组织均表达了 34 ku的 UT-B,然而所有检测的腮腺样品中均表达了 30、50和 54 ku的UT-B,前胃(瘤胃、网胃和瓣胃)样品中表达了30 ku的 UT-B,肝脏样品中表达了 54 ku的 UT-B。此外,一些样品中还表达了其他分子质量的UT-B,比如 5和 6号(CL组的瓣胃和皱胃)样品中表达了 40 ku的 UT-B、30号(CH组的瓣胃)样品中表达了50 ku的 UT-B。研究认为,32～36 ku的UT-B为未糖基化的 UT-B,可调控尿素双向跨消化道(瘤胃壁)转运[8],因此本研究仅对 34 ku UT-B的相对表达量进行分析。各组试验羊消化系统的34 ku UT-B的相对表达量差异性如表 3所示。相对定量分析结果:组间比较发现,CL组 34 ku UT-B的相对表达量最高,EM组次之,CM组最低;组织间比较发现,34 ku UT-B的相对表达量以肝脏最高,次之为皱胃、网胃、瘤胃背囊、腹囊、腮腺、瓣胃,随后是十二直肠、盲肠、盲肠盲囊、回肠,肾脏最低。

3 讨 论

UT-B是哺乳动物体内存在的尿素易化转运的载体,研究认为 UT-B是 Na-依赖性的尿素易化转运系统。据报道,羔羊的十二指肠、回肠和结肠[11]以及牛的瘤胃腹部[12]均存在 47 ku的UT-B。Marini等[13]研究发现,羔羊肝脏含有 45 ku的UT-B。Ludden等[10]研究发现,羊腮腺、瘤胃背腹囊、网胃、小肠、盲肠、结肠、肝脏和肾脏中都含有32和 47 ku的 UT-B,瘤胃、网胃和肝脏中 32 ku的UT-B较多,而在肠道中 47 ku的 UT-B较多,肾脏中 2种分子质量的 UT-B接近,并认为 32 ku为未糖基化的 UT-B,47 ku为 UT-B的 N端糖基化形式,这类似于 Stewartg等[8]应用 RT-PCR技术推断出牛瘤胃 UT-B为 43～54 ku,利用尤斯灌流室技术发现 UT-B调控尿素双向跨瘤胃壁转运,并发现36 ku为未糖基化的 UT-B。 Simmons等[9]研究饲喂青贮基础饲粮和精料基础饲粮的利木赞杂交肉牛发现,饲喂精料基础饲粮的肉牛瘤胃 UT-B mRNA含量显著增加,表明 UT-B可以调节氮代谢平衡。本研究所测样品中 UT-B基本在 30～54 ku且各组织均含有 34 ku的 UT-B,其他分子质量的UT-B的表达与否因饲粮和组织不同呈现差异。

表3 各组试验羊消化系统 34 ku UT-B的相对表达量Table 3 The relative expression quantity of 34 ku UT-B in digestive system of the goats in each group

研究表明,饲喂低蛋白质饲粮会增加反刍动物消化道对尿素的通透性[9,13-14]。一般认为,低蛋白质饲粮可以促进动物消化道及其他组织中UT的表达。Inoue等[12]研究发现,低蛋白质饲粮促进大鼠肾脏 UT-B的表达,低蛋白质饲粮使大鼠结肠 UT-B表达稍有降低,高蛋白质饲粮则变化不显著。饲喂高蛋白质饲粮的奶牛瘤胃背囊乳头中UT-B表达增强[14],这与本研究结果相同。本研究还发现,瘤胃腹囊、网胃、瓣胃、回肠、盲肠盲囊以及肾脏中的 34 ku UT-B的相对表达量随着饲粮蛋白质水平增加而增加。本研究中,饲粮结构对腮腺 UT-B表达的影响最小,皱胃最大;饲粮高蛋白质水平可促进前胃、回肠、盲肠及盲囊和肾脏中34 ku UT-B的表达,对十二直肠起抑制作用,对腮腺、皱胃和肝脏的影响较小,玉米膨化加工只降低了34 ku UT-B在回肠和肝脏的表达;从组织层次看,34 ku UT-B相对表达量最高为肝脏,次之为皱胃、网胃、瘤胃、腮腺、瓣胃,随后为肠道组织,肾脏最低。因此,可以认为饲粮结构可调控 34 ku UT-B在山羊消化系统中的表达。

4 结 论

在综合考虑饲粮蛋白质水平和碳水化合物的形式对内蒙古白绒山羊瘤胃内环境的影响的情况下,通过改变饲粮结构可以调控山羊消化系统各组织中的 UT-B的表达,为进一步研究尿素循环和机体氮代谢提供依据。

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