饲料中添加核苷酸混合物对凡纳滨对虾幼虾非特异性免疫和抗氧化指标的影响

许丹丹 黄燕华 曹俊明 蓝汉冰 王国霞 张荣斌,3 陈晓瑛 严 晶,3

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)因其具有抗逆能力强、生长速度快、饲料转化效率和加工出肉率高等诸多优点,已成为世界三大对虾养殖品种之一。近年来,由于养殖环境恶化,非传染性疾病和传染性疾病滋生等一系列问题,造成养殖对虾机体氧化损伤严重,免疫力下降,生长速度降低甚至死亡[1-3]。目前,许多学者开始把注意力转移到对虾免疫能力的营养调控方面,并越来越重视提高虾类自身的抗病及抗应激能力。一般认为,甲壳动物的免疫主要为非特异性免疫,主要包括血细胞的吞噬、包掩[4]以及血淋巴中的各种因子或酶等的杀菌、抗菌作用[5-6]。核苷酸是组成细胞的主要成分,是 DNA和 RNA的基本组成单位,在生物体内具有信息编码、调节代谢、传递信号、作为辅酶等重要的生理和生化功能[7]。近年来,对小鼠[8-9]及人[10-11]的研究表明,机体许多代谢旺盛的组织(小肠、大肠、淋巴)和细胞(红细胞、白细胞、骨髓细胞)从头合成核苷酸的能力有限,需要补充外源核苷酸。对哺乳动物及畜禽的研究表明,饲料核苷酸可以加快动物的生长速度,提高动物的生产性能[12-13],增强巨噬细胞的吞噬作用[14-15]以及强化自然杀伤细胞的活性[16]。Li等[17]和 Devresse[18]分别综述了核苷酸在鱼类和虾类的研究现状,表明外源核苷酸可以促进鱼类和虾类生长,并影响先天免疫系统的激素分泌和细胞组成,增强免疫因子在应激时快速增长和快速应答的能力。核苷酸自身的碱性氮原子可以捕捉机体氧化过程中形成的自由基,具有保护血细胞膜脂质过氧化物及由过氧化损伤造成的红细胞破裂作用[19]。本研究室前期试验结果显示,饲料中添加一定量的鸟苷酸钠盐可在一定程度上提高凡纳滨对虾的增重率、体蛋白质及脂肪的含量以及血清和肝胰腺中总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性[20]。饲料中添加一定量的核苷酸粗提物能显著提高凡纳滨对虾的增重率,降低饲料系数,提高全虾粗蛋白质和粗脂肪含量[21]。为进一步了解核苷酸对凡纳滨对虾非特异性免疫及抗氧化能力的作用,本试验拟在饲料中添加不同水平的核苷酸混合物,观察其对凡纳滨对虾幼虾血清、肝胰腺非特异性免疫及抗氧化相关指标的影响,以便为核苷酸在凡纳滨对虾饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 核苷酸混合物

5′-胞苷酸、5′-腺苷酸、5′-尿苷酸二钠、5′-肌苷酸二钠、5′-鸟苷酸二钠均由南京同凯兆业生物技术有限责任公司提供,纯度均大于 99%。核苷酸混合物由上述 5种核苷酸按照质量比1∶1∶1∶1∶1的比例混匀后制得 。

1.2 试验饲料

以鱼粉、酪蛋白、大豆浓缩蛋白为主要蛋白质源,鱼油为主要脂肪源,高筋面粉为主要糖源,配制蛋白质和脂肪水平分别为 43.37%和 10.41%的基础饲料[20-23],其组成及营养水平见表 1。在基础饲料中分别添加 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/kg的核苷酸混合物,配制成 8种试验饲料 ,分别记 为 G0、G0.1、G0.2、G0.4、G0.6、G0.8、G1.0、G1.2。饲料原料粉碎后过 60目筛,微量成分采取逐级扩大法添加,核苷酸混合物先溶于水,然后混入饲料中。所有原料全部混合均匀后用 SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为1.0 mm的颗粒料,在 55℃下烘干,冷却后放入密封袋中于 -20℃冰箱中保存待用。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 试验动物与饲养管理

凡纳滨对虾购自珠海斗门虾苗场,饲养试验在广东省农业科学院畜牧研究所水产研究中心室内循环水养殖系统中进行。试验水源为经沙滤、消毒后的天然海水与自来水混合后的咸淡水,盐度为4.5‰～5.5‰,玻璃纤维桶容积为 350 L(直径80 cm,高 70 cm,水体容积 300 L),进水速率为1.4 L/min。试验期间以自然光为光源,光周期为自然光周期,水温 25～30℃,pH 7.7～8.0,溶氧 ＞5 mg/L,氨氮≤0.02 mg/L,亚硝酸盐≤0.2 mg/L。试验虾先在室外循环水泥池中用虾苗场的幼虾饲料将虾苗培育至 0.43 g左右。试验时选择 960尾对虾,随机分成 8组(每组设 3个重复,每个重复 40尾虾),分别投喂 1种试验饲料,养殖期为 5周。采用饱食投喂法,每天分别在 8:00、15:00和 20:00分 3次投喂,投饲后 30 min吸出残饵,同时根据摄食情况及时调整投饲量。每天观察对虾健康状况,记录死亡情况。

1.4 样品采集与测定

试验结束时,禁食 24 h,每个重复随机取 15尾虾,用 1 mL无菌注射器插入心脏取血,合并置于无菌 Eppendorf管中,4℃冰箱静置过夜后10 000 r/min离心 10 min,移出血清分装,于 -20℃冰箱中保存备用。每个重复随机取 5尾虾,分别剥离肝胰腺和肌肉,置于无菌 Eppendorf管中,于 -80℃冰箱中保存备用。分别称取 0.3 g左右肝胰腺和肌肉,剪碎,放入玻璃匀浆器中,按 1∶9的体积比加入生理盐水匀浆,制成 10%肝胰腺匀浆液和肌肉匀浆液,在4℃下 3 000 r/min离心 10 min,取上清液,分装后于-20℃冰箱中保存备用。

酶活测定:血清和肝胰腺中总抗氧化能力(T-AOC),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(AKP)活性和丙二醛(MDA)含量以及肌肉中抗超氧阴离子自由基(O-2◦)活性采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定,具体测定方法按照试剂盒的说明进行。

血细胞计数:每个重复随机取 5尾虾,用 1 mL无菌注射器插入心脏取血,合并置于无菌 Eppendorf管中。吸取 150μL抗凝剂[参照 Franciso等[24]的方法配制,具体方法如下:NaCl 2.628 0 g、KCl 0.074 5 g、EDTA-Na 0.372 2 g、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)0.238 3 g,蒸馏水定容至 100 mL]于无菌 Eppendorf管中,注入凡纳滨对虾血液 100μL,迅速混匀,制备抗凝血。取 50μL抗凝血,加入 10 mL pH为 7.3的 PBS缓冲液进行 500倍稀释,用细胞计数仪(Z2coulter,BECKMAN COULTER)进行计数。

1.5 数据统计与分析

结果以平均值 ±标准差表示,数据采用 SPSS 16.0软件进行处理与分析,先对数据作单因素方差分析(One-way ANOVA),若组间有显著差异,再进行 Duncan氏多重比较,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 对虾血细胞总数及血清中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性

由表 2可知,凡纳滨对虾血细胞总数随饲料核苷酸混合物添加量的增加先增加后降低,其中 G0.4和 G0.6组极显著高于对照组(P＜0.01),G0.8、G1.0和 G1.2组显著高于对照组(P＜0.05)。饲料中添加核苷酸混合物可提高血清 SOD活性,其中G0.6和 G0.8组分别比对照组提高了 15.27%和16.07%,达到显著水平(P＜0.05)。G0.4组血清T-AOC比对照组提高了 50.98%(P＞0.05),并显著高于 G1.2组(P＜0.05),其他各组间无显著差异(P＞0.05)。血清 POD和 AKP活性随着核苷酸混合物添加量的增加均呈先升高后降低的趋势,但各组间差异不显著(P＞0.05)。

2.2 对虾肝胰腺中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性

由表 3可知,各组肝胰腺 SOD活性和 T-AOC先是随饲料中核苷酸混合物添加量的增加而升高,均在 G0.4组达到最高值,而后随着核苷酸混合物添加量的进一步增加,二者都呈现下降趋势(P＜0.05),其中 G0～G0.6组 SOD活性显著高于 G1.0组(P＜0.05),G0.1～G0.6组 T-AOC显著高于G1.2组(P＜0.05),其他各组间无显著差异(P＞0.05)。肝胰腺中 POD和 AKP活性随着核苷酸混合物添加量的增加均呈先升高后降低的趋势,但各组间未出现显著差异(P＞0.05)。

2.3 对虾肝胰腺和血清中 MDA含量及肌肉中抗活性

由表 4可知,凡纳滨对虾肝胰腺中 MDA含量随着核苷酸混合物添加量的增加而降低,其中G0.2～G1.2组显著低于对照组(P＜0.05);各添加组对虾血清中 MDA含量与对照组相比呈现降低的趋势,但差异不显著(P＞0.05)。G0.2～G0.6组肌肉中抗 O-2◦活性显著高于 G1.0和 G1.2组(P＜0.05),其他各组间差异不显著(P＞0.05)。

表2 核苷酸混合物对凡纳滨对虾幼虾血细胞总数及血清中T-AOC和 SOD、POD、AKP活性的影响Table 2 Effects of nucleotide mixture on total haemocytes count,serum T-AOC,and activities of SOD,POD and AKP of juvenile Litopenaeus vannamei

表3 核苷酸混合物对凡纳滨对虾幼虾肝胰腺中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性的影响Table 3 Effects of nucleotide mixture on hepatopancreas T-AOC and activities of SOD,POD and AKP of juvenile Litopenaeus vannamei

表4 核苷酸对凡纳滨对虾幼虾肝胰腺和血清中MDA含量及肌肉中抗 O2-◦活性的影响Table 4 Effects of nucleotide mixture on hepatopancreas and serum MDA content and muscle anti-O2-◦activity of juvenile Litopenaeus vannamei

3 讨 论

甲壳动物缺乏像高等动物那样的由免疫球蛋白介导的特异性免疫机能,其免疫主要为非特异性免疫。本试验显示,饲料中添加核苷酸混合物提高了凡纳滨对虾血细胞总数。血细胞在非特异性免疫反应中起着重要作用,血细胞总数的高低在一定程度上能体现机体抵抗病原体入侵能力的强弱[25]。Burrells等[26]用添加了核苷酸的鲑鱼商品饲料(EWOSVEXTRA Alph,粒径为 3 mm)饲喂感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、感染传染性鲑鱼贫血症病毒(infectious salmon anaemia,ISA)和鱼虱子(Lepeophtheirus salmois)的大西洋鲑鱼(Salmo salar)、感染鲑立克次氏体属(Piscirickettsia salmonis)微生物的银大麻哈鱼(Oncorhynchus kisutch),结果显示,核苷酸能显著降低虹鳟、大西洋鲑鱼和银大麻哈鱼的死亡率;Leonardi等[27]在虹鳟体内注射胰腺坏死病毒后饲养60 d,发现未添加核苷酸组的鱼全部死亡,而添加核苷酸组的鱼全都存活。这可能是由于血淋巴细胞补救合成嘧啶核苷酸的能力有限,而迅速分化的淋巴细胞对嘧啶核苷酸需要量又很大,因此饲料中补充外源核苷酸可以促使血细胞总数增加[28],从而提高免疫力。

本试验结果表明,凡纳滨对虾幼虾血清中 SOD活性随核苷酸混合物添加量的升高而提高,饲料中添加一定量的核苷酸混合物能够提高血清和肝胰腺中 T-AOC以及肝胰腺中 SOD活性,但核苷酸混合物添加量过高(1.0和 1.2 g/kg)时,SOD活性和T-AOC有下降趋势;外源核苷酸对血清和肝胰腺中的 POD和 AKP活性的影响不显著。这与在凡纳滨对虾[29]、鲤鱼 (Cyprinus carpio)[30]及异育银鲫(Carassiusauratus gibelio)[31]中的研究结果一致。这表明外源核苷酸可以提高凡纳滨对虾部分免疫因子的活性,但过度添加核苷酸并不能强化已处于正常状态下的免疫系统。外源核苷酸影响机体非特异性免疫功能的机理还不是很清楚。本试验还发现,外源核苷酸可以极显著提高血细胞总数,而有报道指出体液因子可在血细胞中合成并释放,细胞反应又受体液因子的介导和影响[32],因此,本文作者认为,外源性核苷酸可能通过这二者的协同作用来提高对虾机体的免疫力。外源核苷酸提高机体相关免疫因子活性的另一个可能的原因是促进免疫相关基因的表达。Low等[33]检测了以核苷酸饲料饲喂 15周的大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特异免疫相关基因的表达量,发现脾脏和鳃中免疫球蛋白 M(IgM)和重组激活基因 -1(RAG-1)以及肾脏中白介素 -1β(IL-1β)的基因表达量显著高于未添加组。关于外源性核苷酸对凡纳滨对虾非特异性免疫相关基因表达等分子生物学机制,尚值得深入分析。

MDA是脂质过氧化典型的代表产物,它可以衡量机体的抗氧化状态,又能间接反映出细胞损伤程度。O-2◦是多种自由基的派生源,可以经过一系列反应生成其他自由基,不仅其衍生的自由基具有细胞毒性,O-2◦本身也有毒害作用,会导致细胞DNA损坏,破坏机体功能[34]。O-2◦会对机体产生损伤作用,但机体内也存在着对抗自由基的酶系统。本试验结果显示,饲料中添加核苷酸混合物能显著降低肝胰腺中 MDA含量,一定程度提高肌肉中抗◦活性。这表明外源核苷酸有助于清除凡纳滨对虾组织中的自由基,阻止脂质过氧化作用。各组织中 MDA的降低趋势与抗 O-2◦、SOD、POD活性和T-AOC的变化趋势相反,可能是由于这几种酶都可以催化◦发生歧化反应从而将其消除,防止生物脂质过氧化损伤。王宝杰等[35]研究发现,SOD对血细胞吞噬过程中 O-2◦的产生有抑制作用。另外有报道认为,核苷酸本身具有抗氧化的作用,其碱基的氮原子能够捕获亚油酸氧化过程中形成的自由基,并能螯合加速氧化的铜、铁等离子,减少由脂质过氧化引起的细胞膜及 DNA的损伤[19]。钱佳等[36]研究发现,鸟苷酸二钠(GMP◦Na2)具有剂量依赖性的体外抗氧化和清除活性氧的能力,10 mmol/L GMP◦Na2添加组的羟自由基清除能力高达 96.64%。关于外源核苷酸对水产动物组织中脂质过氧化物含量的影响及核苷酸本身抗氧化作用的研究较少见报道,有关问题仍有待进一步的研究。

本试验以组织脂质过氧化物含量及抗 O-2◦活性作为指标,并结合 SOD、POD活性和 T-AOC等,探讨了外源性核苷酸对凡纳滨对虾抗氧化能力的影响,但关于其进一步的作用机理,尚有待于深入研究。根据凡纳滨对虾非特异性免疫相关指标血细胞总数,血清和肝胰腺中 SOD活性、T-AOC及肌肉中抗 O-2◦活性出现最大值的范围及 MDA含量出现最小值的范围综合分析,建议饲料中核苷酸混合物的添加量为 0.4～0.6 g/kg。

4 结 论

①饲料中添加一定量的核苷酸混合物能显著提高凡纳滨对虾幼虾血细胞总数和血清中 SOD活性,对 T-AOC及 POD、AKP活性有提高的趋势。

②饲料中添加一定量的核苷酸混合物可一定程度地提高凡纳滨对虾幼虾肝胰腺中 SOD、POD和AKP活性及 T-AOC。

③饲料中添加一定量的核苷酸混合物可显著降低凡纳滨对虾幼虾肝胰腺中 MDA含量,提高肌肉中抗 O-2◦活性。

④综合分析以上相关指标,建议凡纳滨对虾幼虾饲料中核苷酸混合物的添加量为 0.4～0.6 g/kg。

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