谷氨酰胺与鱼类消化系统生长发育以及肠上皮细胞蛋白质合成和抗氧化能力的关系

姜 俊 冯 琳 胡 凯 刘 扬 李树红,2 周小秋＊

谷氨酰胺(Gln)是鱼类血液中含量丰富的游离氨基酸之一[1],饲料中添加 Gln可提高鱼类的饲料效率、营养物质利用率和生长性能[2-4],增强鱼体免疫功能和疾病抵抗力[2-3,5]。近年研究表明,Gln可提高鱼类肠上皮细胞蛋白质合成和抗氧化能力,改善消化道黏膜上皮形态结构,促进消化道和消化腺的生长发育[2,6-9]。本文就 Gln对鱼类消化道生长发育、肠上皮细胞蛋白质合成及抗氧化能力的影响及机理做一综述。

1 Gln对鱼类消化道生长发育的影响

肠道是鱼类消化吸收营养物质的主要场所,鲤鱼等无胃鱼类尤其如此。肠道的功能与其生长发育密切相关。肠长指数、肠体指数和肠道蛋白质含量可反映鱼类肠道的生长发育状况。研究发现,Gln对鱼类肠长指数、肠体指数和肠蛋白质含量有显著影响[10]。饲料中添加 Gln可使建鲤肠长指数、肠体指数和肠道蛋白质含量显著提高,分别提高了 9%、49%和 30%[2]。

肠黏膜上皮直接与肠道中食糜、各种病原微生物和抗原物质接触,其生长发育和结构完整是肠道消化吸收和免疫屏障功能正常的重要保证[11]。肠黏膜皱襞高度以及碱性磷酸酶(AKP)和 Na+,K+-ATP酶(Na+,K+-ATPase)活力是肠黏膜生长发育的重要标志[10,12-13]。研究发现,饲料中添加 1.2%Gln对建鲤肠黏膜皱襞高度以及AKP和 Na+,K+-ATPase活力有显著影响[2](表 1);饲料中添加 0.5%Gln后,哲罗鱼肠道Na+,K+-ATPase活力提高了 71%[14]。

肠黏膜的形态结构是肠黏膜上皮功能正常的基础,组织显微观察是肠黏膜形态结构研究的重要手段。显微结构观察发现:饲料未添加 Gln,建鲤前、中、后肠黏膜皱襞顶端上皮细胞脱落,皱襞排列不齐,而添加 1.2%Gln,建鲤前、中、后肠黏膜皱襞结构完整,黏膜上皮细胞无明显脱落[15]。

2 Gln对鱼类消化腺生长发育的影响

鱼类消化腺包括胰脏、肝脏和肠腺,但有的鱼类的肝脏形态没有规则,呈弥散状分布在肠系膜上,而且肝脏组织中混杂着胰脏组织,因此合称肝胰脏。胰腺分泌的蛋白酶、脂肪酶是鱼类蛋白质和脂肪消化的主要酶来源[16]。胰腺消化酶分泌能力与胰脏生长发育密切相关,肝体指数和肝胰脏蛋白质含量均可反映肝胰脏的生长发育状况[10]。研究发现,饲料添加 1.2%Gln,建鲤肝胰脏重量和蛋白质含量显著提高,肝体指数和肝胰脏蛋白质含量分别提高了 40%和 28%[2]。

表1 Gln对建鲤肠黏膜酶活力和皱襞高度的影响Table 1 Effects of glutamine on enzyme activities and folds height in intestinal mucosa of Jian carp %

鱼类肠道的蛋白酶、脂肪酶等消化酶主要来源于胰腺分泌,胰腺分泌的蛋白酶和脂肪酶均以酶原形式进入肠腔后由肠道中的肠激酶或胆盐等相应物质激活[16],因此肠道蛋白酶和脂肪酶活力可以反映胰腺消化酶的分泌能力[10]。研究发现,饲料中添加 Gln,建鲤前、中、后肠[2]和哲罗鱼肠道[14]蛋白酶和脂肪酶活力均显著提高(表 2)。这表明饲料中添加 Gln可能提高了鱼类胰腺蛋白酶和脂肪酶的分泌能力,使得鱼类各肠段蛋白质和脂肪的消化能力增强。

表2 Gln对鱼类肠道消化酶活力的影响Table 2 Effects of glutamine on intestinal digestion enzyme activities of fish

3 Gln对鱼类肠上皮细胞蛋白质合成及抗氧化能力的影响及机制

3.1 Gln对鱼类肠上皮细胞蛋白质合成的影响及机制

肠上皮细胞蛋白质合成能力对鱼类肠上皮细胞增殖分化和肠道生长发育有非常重要的作用[8]。肠上皮细胞蛋白质合成能力常用蛋白质合成率来反映[17]。研究发现,培养液中添加 1 mg/L Gln,鱼类前肠和中肠上皮细胞的蛋白质合成率分别提高了 21%和 123%,但后肠上皮细胞蛋白质合成率无显著变化,表明 Gln可提高鱼类前肠和中肠上皮细胞蛋白质合成能力,对后肠上皮细胞蛋白质合成能力无影响[7]。其不同肠段试验结果差异的原因可能与鱼类不同肠段肠上皮细胞蛋白质合成的特点有关,鱼类前、中、后肠上皮细胞的蛋白质合成能力依次降低,其具体差异原因有待研究。

关于 Gln提高鱼类肠上皮细胞蛋白质合成能力的机制,目前仅见 1篇研究。雷帕霉素靶蛋白(TOR)是细胞蛋白质合成调控的关键信号分子,可激活核糖体小亚基 S6激酶(p70S6K)和抑制真核转录起始因子 -4E结合蛋白(4E-BP)活性,以调控细胞蛋白质合成能力[18]。研究发现,培养液中单独添加 Gln后鱼类肠上皮细胞蛋白质合成率提高了 125%,同时添加 Gln和 TOR特异性抑制剂雷帕霉素(RAP)后蛋白质合成率提高了 73%,同时添加Gln和谷氨酰胺酶特异性抑制剂正异亮氨酸(DON)后蛋白质合成率提高了 91%,同时添加 Gln、RAP和 DON后蛋白质合成率提高了23%,说明 Gln可通过 TOR信号途径、谷氨酰胺酶途径及其他未知途径来提高鱼类肠上皮细胞蛋白质合成能力;进一步研究发现,Gln可促进鱼类肠上皮细胞 TOR和谷氨酰胺酶基因的表达,其mRNA丰度分别提高了 47%和 26%[7]。因此,Gln可通过提高鱼类肠上皮细胞 TOR和谷氨酰胺酶基因表达,增强 TOR信号,提高肠上皮细胞 Gln代谢利用能力,从而提高鱼类肠上皮细胞的蛋白质合成能力。关于 Gln促进鱼类肠上皮细胞蛋白质合成的具体信号调控分子机制尚未见相关报道。对鼠肠上皮细胞的研究表明,Gln在氨基酸通过TOR信号调控鼠肠上皮细胞生长中起着关键性调控作用[19]。

3.2 Gln对鱼类肠上皮细胞抗氧化能力的影响及机制

肠上皮细胞极易受到各种氧化物的损伤和破坏,从而严重影响鱼类肠道生长发育和消化吸收及免疫屏障功能[20-21]。细胞和组织丙二醛(MDA)和蛋白质羰基(PCA)含量是衡量细胞和组织脂质和蛋白质氧化损伤程度以及细胞和组织的抗氧化能力的重要标识[22-23]。研究发现,添加Gln对鱼体组织和肠上皮细胞的 MDA和 PCA含量有显著的影响。在 H2O2的氧化应激下,培养液中添加 Gln,肠上皮细胞 MDA和 PCA含量较不添加 Gln的氧化应激组分别降低了 43%和 60%,与对照组差异不显著[9]。饲料中添加 Gln,哲罗鱼肠道和鱼体组织 MDA含量分别下降 56%和36%[14]。

关于Gln提高鱼类肠上皮细胞抗氧化能力的机制,目前已有研究报道。研究表明,Gln主要通过影响细胞抗氧化酶系统和非酶系统 2种途径来提高肠上皮细胞的抗氧化能力。在 H2O2的氧化应激下,培养液中添加 Gln使肠上皮细胞超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和谷胱甘肽(GSH)含量较氧化应激组分别提高了 20%、259%、59%和67%,与对照组差异不显著,且与细胞 MDA和PCA含量呈显著负相关关系[9]。饲料中添加Gln,哲罗鱼肠道[14]及其鱼体组织[24]SOD活力分别提高 60%和 62%,与组织 MDA含量呈显著负相关关系。可见,添加 Gln可以提高鱼类肠道和肠上皮细胞的抗氧化能力,保护肠上皮细胞脂质和蛋白质免受 H2O2的氧化损伤,有利于肠道生长发育和肠黏膜结构的完整。

关于 Gln提高鱼肠上皮细胞酶性和非酶性抗氧化能力的分子信号机制,目前还未见相关报道。在鼠上的研究结果表明,饲粮添加 Gln可提高GSH合成底物谷氨酸的含量,从而促进 GSH合成并增强肠上皮细胞的非酶抗氧化能力[25]。在哲罗鱼上的研究发现,饲料添加 Gln极显著提高了鱼体[14]和肠道组织[24]的谷氨酸含量。可见,Gln可能通过与鼠相似的途径提高鱼类肠上皮细胞的非酶抗氧化能力。

4 小 结

添加 Gln可促进鱼类消化道生长发育,改善肠黏膜上皮形态结构,促进消化腺生长发育,提高蛋白酶和脂肪酶活力。Gln通过 TOR信号和谷氨酰胺酶途径提高鱼类肠上皮细胞蛋白质合成能力,通过提高酶性和非酶性抗氧化能力保护肠上皮细胞免受氧化损伤,进而促进鱼类消化道和消化腺生长发育,改善肠黏膜的形态结构。Gln促进鱼类消化道生长发育的分子信号机制需进一步深入研究。

[1] MARC R J,WU G.Glutamine,arginine,and leucine signaling in the intestine[J].Amino Acids,2009,37:111-122.

[2] LIN Y,ZHOU X Q.Dietary glutamine supplementation improves structure and function of intestine of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture,2006,256:389-394.

[3] 杨奇慧,周歧存,谭北平,等.谷氨酰胺对杂交罗非鱼生长、饲料利用及抗病力的影响[J].中国水产科学,2008,15:1016-1023.

[4] 徐奇友,王常安,许红,等.外源性谷氨酰胺对虹鳟稚鱼生长和肠道形态的影响[J].中国粮油学报,2009,24:98-102.

[5] 叶均安,王冰心,孙红霞,等.谷氨酰胺二肽对日本对虾血清生化指标、肝胰腺细胞凋亡及肠黏膜形态的影响[J].海洋与湖沼,2009,40:347-352.

[6] 姜俊.谷氨酰胺对鲤鱼肠上皮细胞生长和代谢的影响[D].硕士学位论文.雅安:四川农业大学,2005:12-43.

[7] 姜俊.鲤鱼 IECs GLS和 TOR基因 cDNA克隆及Gln对 IECs蛋白合成的影响和机理研究[D].博士学位论文.雅安:四川农业大学,2009:39-71.

[8] JIANG J,ZHENG T,ZHOU X Q,et al.Influence of glutamine and vitamin Eon growth and antioxidant capacity of fish enterocytes[J].Aquaculture Nutrition,2009,15:409-414.

[9] CHEN J,ZHOU X Q,FENG L,et al.Effects of glutamine on hydrogen peroxide-induced oxidative damage in intestinal epithelial cells of Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture,2009,288:285-289.

[10] ZHOU X Q,ZHAO C R,LIN Y.Compare the effect of diet supplementation with uncoated or coated lysine on juvenile Jian carp(Cyprinus carpio Var.Jian)[J].Aquaculture Nutrition,2007,13:457-461.

[11] CAIN K,SWAN C.Barrier function and immunology[M]//MARTIN-GROSELL A P F,COLIN J B.Fish physiology.New York:Academic Press,2010:111-134.

[12] VILLANUEVA J,VANACORE R,GOICOECHEA O,et al.Intestinal alkaline phosphatase of the fish Cyprinus carpio:regional distribution and membrane association[J].Journal of Experimental Zoology,1997,279:347-355.

[13] VEILLETTEP.Temporal changes in intestinal Na+,K+-ATPase activity and in vitro responsiveness to cortisol in juvenile chinook salmon[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular＆Integrative Physiology,2004,138:297-303.

[14] 徐奇友,王常安,许红,等.饲料中添加谷氨酰胺二肽对哲罗鱼仔鱼肠道抗氧化活性及消化吸收能力的影响[J].中国水产科学,2010,17:351-356.

[15] 林燕.谷氨酰胺对幼建鲤肠道功能和免疫力的影响[D].硕士学位论文.雅安:四川农业大学,2005:25-37.

[16] EVANS D H,CLAIBORNE J B.The physiology of fishes[M].Boca Raton,FL:CRC,Taylor＆Francis,2006:305-366.

[17] HIGASHIGUCHI T,NOGUCHI Y,MEYER T,et al.Protein synthesis in isolated enterocytes from septic or endotoxaemic rats:regulation by glutamine[J].Clinical Science,1995,89:311-319.

[18] WULLSCHLEGER S,LOEWITH R,HALL M N.TOR signaling in growth and metabolism[J].Cell,2006,124:471-484.

[19] NAKAJO T,YAMATSUJI T,BAN H,et al.Glutamine is a key regulator for amino acid-controlled cell growth through the mTORsignaling pathway in rat intestinal epithelial cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,326:174-180.

[20] JIANG W D,FENG L,LIU Y,et al.Myo-inositol prevents oxidative damage,inhibits oxygen radical generation and increases antioxidant enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture Research,2009,40:1770-1776.

[21] JIANG W D,FENG L,LIU Y,et al.Lipid peroxidation,protein oxidant and antioxidant status of muscle,intestine and hepatopancreas for juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of myo-inositol[J].Food Chemistry,2010,120:692-697.

[22] MARTENSSON J,JAIN A,MEISTER A.Glutathione is required for intestinal function[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,1990,87:1715-1719.

[23] DALLE-DONNE I,ROSSI R,GIUSTARINI D,et al.Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress[J].Clinica Chimica Acta,2003,329:23-38.

[24] 徐奇友,王常安,许红,等.丙氨酰 -谷氨酰胺对哲罗鱼仔鱼生长和抗氧化能力的影响[J].动物营养学报,2009,21:1012-1017.

[25] CRUZAT V F,TIRAPEGUI J.Effects of oral supplementation with glutamine and alanyl-glutamine on glutamine,glutamate,and glutathione status in trained rats and subjected to long-duration exercise[J].Nutrition,2009,25:428-435.