酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌对早期断奶犊牛生长性能和胃肠道发育的影响

周 怿 刁其玉 屠 焰 云 强

胃肠道既是动物消化食物,吸收营养的主要场所,也是机体内的第一道防御屏障。定植于动物胃肠道中的良好的微生物菌群对肠道的组织形态、代谢和功能有极大的影响[1],有助于更大程度地发挥动物的生长性能。新生犊牛由于胃肠道消化机能及免疫屏障功能发育不健全,极易受病原微生物的侵害而引起腹泻,导致高发病率和高死亡率[2]。饲用抗生素(antibiotics)通过非选择性抑菌或杀菌作用,可消除肠道有害微生物对犊牛生长的抑制作用。但是近年来,鉴于抗生素的大量使用导致了肠道菌群失衡等负效应,各国对抗生素的使用管理也越来越严格。因此,益生素(probiotics)的研究和应用逐步成为研究热点之一。研究表明,在 5周龄内犊牛的代乳粉中添加抗生素和益生素对于降低犊牛腹泻和提高生长性能具有相似的效果[3-4]。研究进一步证实,益生素可抑制由溶血性大肠杆菌导致的幼龄反刍动物腹泻,进而促进幼龄反刍动物的生长[5]。

酵母 β-葡聚糖不同于植物细胞壁中的 β-(1→4)葡聚糖,酵母 β-葡聚糖主要来源于酵母细胞壁,是由 D-葡聚糖通过 β-(1→3)键的方式相结合,并含有高度分支的 β-(1→6)键结合的多聚糖。它在消化道中不可溶,不吸收,同时不产生黏性。目前,关于酵母 β-葡聚糖在幼龄反刍动物中应用的研究报道较少,特别是关于它对犊牛肠道微生物区系影响的报道就更为少见。本试验拟从早期断奶犊牛生长性能、肠道主要微生物数量及胃肠道组织发育 3方面来比较酵母 β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛肠道发育的影响,以期为早期断奶犊牛胃肠道发育调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酵母 β-葡聚糖为淡黄色粉末,购自珠海天添生物工程技术有限公司(批号 20080701),干物质含量 95.58%,粗蛋白质含量 4.57%,纯度为82.75%。杆菌肽锌为淡褐色粉末,购自天津新星兽药厂,含量 15%。大肠杆菌购自中国兽医药品监察所,菌株号 cvcc 222,血清型 O141∶K99,是引起犊牛腹泻的主要治病菌。

1.2 饲养管理与试验饲粮

试验在中国农业科学院南口中试基地进行。选取 20头新生健康荷斯坦公犊牛(购自三元奶牛场),按体重和出生时间一致原则随机分成 4组,每组 5个重复,每个重复 1头牛。犊牛 1～7日龄饲喂鲜乳,饲喂量为犊牛体重的 8%。饲养试验于犊牛 1周龄时进行,全期共 28 d。

试验基础饲粮包括犊牛代乳粉和开食料 2部分。整个试验期内每天分别于 08:00和 18:00饲喂犊牛代乳粉饲粮[6](用煮沸后冷却至 40～45℃的热水与代乳粉干物质按 7∶1的重量比冲泡),乳液饲喂量为犊牛体重的 10%。于犊牛第 21日龄起开始训练犊牛采食开食料饲粮,各组犊牛开食料的饲喂采用限饲制度,每头犊牛每天补饲300 g,自由饮水,记录每天采食量。每头犊牛单独饲养于 0.9 m×3.5 m的犊牛围栏,下铺设漏缝地板。

试验用代乳粉为中国农业科学院饲料研究所家畜营养与饲料研究室研发的产品,开食料组成及营养水平与代乳粉营养水平见表 1和表 2。

表1 开食料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of starter diet(air-dry basis) %

表2 代乳粉营养水平(风干基础)Table 2 Nutrient levels of milk replacer(air-dry basis)%

1.3 试验设计

试验采用单因素试验设计,A组为对照组,B、C、D组为试验组,具体见表 3。在试验第 21天晨饲时,通过将大肠杆菌肉汤培养基(109个/mL)混入犊牛代乳品中对 A、B、D 3组进行口服大肠杆菌攻毒,攻毒剂量约为 30 mL。

表3 试验设计表Table 3 Experimental design table

1.4 样品采集、测定项目与方法

1.4.1 生长性能

在试验开始第 1、14、21、28天晨饲前 ,称取每头犊牛的空腹体重。每日记录犊牛代乳粉和开食料的耗料量。统计各阶段犊牛的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和饲料转化率(F/G)。

1.4.2 直肠中主要微生物数量的测定

于试验第 21天分别采集攻毒后 3、12、24 h犊牛直肠内约 10 cm处靠近上壶腹黏膜部的粪便样品,无菌操作,迅速带回实验室,放入带有玻璃珠的三角瓶中,称重后以 1∶9(W/W)的比例加入无菌生理盐水,依次以 10倍梯度稀释,选择适宜的稀释度,分别涂布在乳酸菌选择性培养基(MRS)、伊红美蓝琼脂培养基(EMB)(均购于北京陆桥技术有限责任公司),每个梯度做 3组重复,于 37℃恒温培养箱分别培养 72、24 h后计算菌落数,并以用 1 g肠道内容物中细菌个数的对数[lg(cfu/g)]表示直肠内容物中主要微生物数量[7]。

1.4.3 胃肠道组织形态学观察

试验第 28天晨饲前从各组随机选取 3头犊牛,用 4%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg BW)将犊牛完全麻醉后,剖开腹腔分别在前背盲囊部分用利剪连续取下 1 cm2的组织块,另取十二指肠近端5 cm处、空肠中段和回肠中段约 1 cm的肠管,用生理盐水冲洗残余内容物后,迅速将样品浸泡至入 4%多聚甲醛 -0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)中固定,4℃固定 48 h后,石蜡包埋做组织切片。瘤胃及肠道固定样品经苏木精 -伊红(HE)染色后,在 10×10倍光镜(Motic BA200)下观测其形态结构的变化,并利用 Motic images advanced 3.2软件测量瘤胃前背盲囊乳头高度、乳头宽度及黏膜厚度,小肠各部位绒毛高度、隐窝深度及黏膜厚度。每个样本观察 2个非连续切片,每张切片选取 3个视野,每个视野分别测定 10组数据,其平均值作为 1个测定数据。

1.5 数据分析与处理

试验数据的统计与分析利用 SAS 8.2软件包中的平衡实验设计方差分析过程(ANOVA)进行,均值的多重比较采用 Duncan氏法进行,以 P＜0.05作为差异显著性判断标准。结果以平均值 ±标准差来表示。

2 结 果

2.1 酵母 β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛生长性能的影响

由表 4可见,大肠杆菌攻毒前,即第 1～14天和第 14～21天 2个阶段时,与对照组相比,B组犊牛ADG分别提高了 26.17%和 24.93%(P＜0.05),D组犊牛 ADG分别提高了 30.89%和28.57%(P＜0.05);大肠杆菌攻毒后,即第 22～28天期间,B、D组 ADG分别比对照组提高了30.38%和 30.81%(P＜0.05),但与 C组差异不显著(P＞0.05)。

对于试验各期 F/G,B、D组均显著低于对照组,特别是大肠杆菌攻毒后,B、D组 F/G比对照组分别降低了 15.74%和 20.81%(P＜0.05),与 C组差异不显著(P＞0.05)。同样的,从试验全期来看,B、D组 F/G比对照组分别降低了 17.53%和19.58%(P＜0.05)。

2.2 酵母 β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛直肠微生物数量的影响

由表 5可见,大肠杆菌攻毒后 3、12和 24 h,B组犊牛直肠中乳酸杆菌数量高于对照组,但是差异不显著(P＞0.05),D组 3个时间点乳酸杆菌数量均显著低于 B、C和对照组(P＜0.05);而 B、C组之间犊牛直肠乳酸杆菌数量无显著差异(P＞0.05)。C组犊牛直肠中乳酸杆菌数量显著高于对照组(P＜0.05)。

与对照组相比,大肠杆菌攻毒后 12 h,B、D组显著降低了犊牛大肠杆菌攻毒后 12和 24 h时直肠中大肠杆菌数量(P＜0.05),分别降低了9.79%、10.09%与 16.35%、15.38%。同时,B组在 12和 24 h时犊牛直肠大肠杆菌数量显著高于C组(P＜0.05)。

表4 酵母β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛生长性能的影响Table 4 Effects ofβ-glucan and antibiotics on growth performance of early-weaned calves

表5 酵母β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛直肠微生物的影响Table 5 Effects ofβ-glucan and antibiotics on microflora in rectum of early-weaned calves lg(cfu/g)

2.3 酵母 β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛胃肠道组织形态学的影响

由表 6可见,与对照组相比,B、C组可显著增加犊牛瘤胃乳头高度、宽度(P＜0.05)。与对照组相比,各组犊牛十二指肠绒毛高度无显著差异(P＞0.05),而 C、D组犊牛十二指肠隐窝深度显著低于对照组和 B组(P＜0.05);B、C和 D组绒毛高度和隐窝深度比(V/C)显著高于对照组(P＜0.05)。

各组犊牛空肠中段绒毛高度和隐窝深度无显著差异(P＞0.05),绒毛高度和隐窝深度比(V/C)也以试验 B、C组显著高于对照组(P＜0.05)。回肠中段各形态指标与空肠中段变化趋势相同,各组间绒毛高度和隐窝深度无显著差异(P＞0.05),但 B、C和 D组 V/C显著高于对照组(P＜0.05)。

表6 酵母β-葡聚糖与杆菌肽锌对早期断奶犊牛瘤胃和小肠形态发育的影响Table 6 Effects ofβ-glucan and bacitracin zinc on rumen and intestinal morphological development of early-weaned calves μm

3 讨 论

3.1 酵母 β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛生长性能的影响

杆菌肽锌是多肽类抗生素,一方面它可以抑制肠内病原性微生物的增殖,促进有益微生物的生长,减少发病率,从而促进动物生长;另一方面,杆菌肽锌可使畜禽肠壁变薄,增加肠黏膜的通透性和改变肠内代谢环境,从而促进营养的消化吸收。研究表明,在火鸡饲粮中添加杆菌肽锌 20、50和 100 mg/kg,饲料转化率分别提高了 0.4%、1.1%和 1.5%,增重分别提高了 1.6%、2.3%和2.8%[8]。据报道,在仔猪饲料中添加杆菌肽锌50 mg/kg,增重比添加土霉素组提高了 22.4%,饲料转化率提高了 14.5%,并证明杆菌肽锌与硫酸抗敌素合用,可明显提高仔猪的增重、饲料报酬及具有良好的预防腹泻效果[9]。

目前,关于 β-葡聚糖对幼龄动物生长性能的影响的报道较多,β-葡聚糖与其他免疫增强剂(如脂多糖)不同,它对动物的食欲、生长没有不良影响[10],并且在饲料中添加 β-葡聚糖可以促进动物生长[11]。在 19日龄断奶仔猪的试验中发现,在饲料中添加 0.05%～0.80%的 β-葡聚糖可显著改善仔猪断奶第 14天后的生长性能,所有β-葡聚糖添加组仔猪的饲料转化率均显著高于对照组(P＜0.05)[12]。而另一些研究认为 β-葡聚糖提高仔猪的生长速度是由于提高了日采食量,对 ADG和 F/G无显著影响[13-14]。本研究发现,大肠杆菌攻毒前,与对照组相比,酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌均可显著提高犊牛 ADG;同样,试验各期 F/G,添加酵母 β-葡聚糖(B组)和杆菌肽锌(D组)均显著低于对照组,而试验各期各组犊牛ADFI均无显著差异。就本试验来看,在正常的饲养模式下,酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌对于提高犊牛生长性能具有相似的效果。

本试验中大肠杆菌攻毒后,B、D组 ADG显著高于对照组,但是与未攻毒组(C组)差异不显著。同样的,B、D组 F/G显著低于对照组,但与未攻毒组差异不显著(P＞0.05)。因此,在本试验攻毒应激模式下,酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌可能会减轻大肠杆菌对犊牛的损伤,并且与未攻毒组差异不显著。对于酵母 β-葡聚糖组来说,试验结果可能是由于在感染前使用 β-葡聚糖可增强机体的免疫清除作用,将抗原抗体反应控制在膜免疫局部,减少了全身免疫的负担,并且这种免疫保护作用是以非炎症的方式来进行的,即对动物的生长没有不良影响。

3.2 酵母 β-葡聚糖与抗生素对早期断奶犊牛直肠微生物数量的影响

研究证实,大肠杆菌、沙门氏菌和乳酸杆菌的生理功能与动物机体的生命活动息息相关[15]。本试验在抑制直肠中大肠杆菌增殖上,酵母 β-葡聚糖的抑菌效果略低于杆菌肽锌。这可能是由于酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌在抑制大肠杆菌增殖上的方式不同,杆菌肽锌对革兰氏阳性细菌有强烈的抗菌作用,对部分革兰氏阴性菌、放线菌、螺旋菌体抑制效果也明显,其机制主要为抑制细菌的细菌壁合成,也能与敏感细菌的细胞膜结合,损伤细胞膜的完整性,导致细胞内重要物质外流,从而阻碍肠道内细菌繁殖。而 β-葡聚糖主要是在结肠微生物的作用下生成短链脂肪酸,而短链脂肪酸能促进肠黏膜的生长。另一方面,β-葡聚糖可通过增加肠道分泌型免疫球蛋白(IgA)的分泌量而减少致病微生物对肠道的黏附,从而减少大肠杆菌增殖[16]。

3.3 酵母 β-葡聚糖与杆菌肽锌对早期断奶犊牛胃肠道发育的影响

众所周知,瘤胃功能的建立是瘤胃内容物经发酵产生的挥发性脂肪酸刺激的结果。Lesmeister等[14]通过统计学分析对试验所需犊牛数量、样品采集部位、样品采集数量等进行讨论,认为在评定瘤胃的指标中,瘤胃乳头的长度是最重要因素,其次是瘤胃乳头的宽度和黏膜厚度。本试验结果显示,瘤胃乳头长度、宽度和黏膜厚度随饲粮中酵母β-葡聚糖含量的增加而增大,其中酵母 β-葡聚糖组显著高于其余各组,这与前述结果相一致,其原因可能是 β-葡聚糖增加了总挥发性脂肪酸的产量,从而刺激瘤胃乳头发育有关。

小肠的正常结构是营养物质被充分消化与吸收的基本保证。特别是小肠的绒毛长度、V/C、黏膜厚度及绒毛表面积是衡量小肠消化吸收功能的重要指标[17-18]。肠绒毛高度与细胞数量呈显著相关。绒毛高,则成熟的上皮吸收细胞多,对肠道营养物质的吸收能力就强,隐窝深度反映了细胞生成率,隐窝基部向绒毛端部迁移、分化,形成具有吸收能力的绒毛细胞,以补充绒毛上皮的正常脱落,基部的细胞生成率降低,使隐窝变浅。V/C综合反映小肠的功能状况[19]。比值上升,则黏膜改善,消化吸收功能增强;比值下降,消化吸收功能降低,动物生长发育受阻。陈代文等[20]研究表明断奶仔猪饲粮由母乳转变为代乳品时如果饲养管理不善,极易加剧肠道对饲粮的过敏反应,仔猪小肠表现为严重绒毛脱落、肠黏膜细胞增生和隐窝细胞有丝分裂速度加快,进而导致了仔猪腹泻。而张运涛等[7]研究表明酵母多糖对小肠黏膜的具有保护作用,扫描电镜观察表明,对照组小肠绒毛变形、微绒毛脱落,而试验组小肠绒毛和微绒毛生长发育正常。本试验结果表明,添加酵母 β-葡聚糖与杆菌肽锌组犊牛小肠各段 V/C显著大于对照组,说明酵母 β-葡聚糖对小肠黏膜具有保护作用,缓解小肠各段由于应激对黏膜的损伤作用,进而提高犊牛对营养物质的消化吸收从而提高犊牛生长速度。

4 结 论

与对照组相比,无论是正常饲养模式还是在口服大肠杆菌肉汤培养基攻毒模式下:

①酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌均均可有效地提高犊牛日增重和饲料转化率。

②酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌对大肠杆菌生长均表现出一定的抑制作用。

③酵母 β-葡聚糖和杆菌肽锌均能促进小肠各段肠黏膜形态发育。

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