CdSe@ZnS量子点在果蝇及其幼虫体内的分布

刘 慧 汪 冰 王 卓 李 明 康艳杰,3秘晓林 余笑寒 丰伟悦

1 (中国科学院高能物理研究所纳米生物效应与安全性重点实验室和核分析技术重点实验室 北京 100049)

2 (烟台大学环境与材料工程学院 烟台 264005)

3 (郑州大学化学系 郑州 450001)

4 (中国科学院上海应用物理研究所 上海 201800)

纳米材料因其小尺寸效应而易穿过各种生物体屏障(如血肺屏障、血脑屏障、皮肤屏障等)，对呼吸系统、心血管系统、中枢神经系统和免疫系统等造成影响[1,2]。胎盘屏障是母婴重要屏障，能防御外来有害物质进入胚胎，保证胎儿在母体内正常发育。纳米材料跨越胎盘屏障的能力、对胚胎早期的组织分化、发育和子代未来健康的潜在影响，是纳米安全性研究的重要内容，受到广泛关注[3,4]。最近，Bai等[5]报道碳纳米管暴露对雄性小鼠的生殖系统产生一定的影响，引起了人们对纳米材料生殖系统安全性研究的重视，但目前有关纳米材料是否能通过母体转运至胚胎还所知甚少。

量子点是新兴的荧光标记材料，与传统有机染料和荧光蛋白相比，其荧光强度高、抗光漂白能力强和发射光谱窄[6]，在活细胞荧光标记、肿瘤细胞示踪、组织成像及动物活体成像等生物领域展现出广泛的应用前景[7−9]。随着量子点的广泛应用，其生物安全性问题引起了科学家的广泛关注[10]。

果蝇体型小，生长周期短(10天左右一代)，繁殖效率高、胚胎发育速度快、能完全变态发育，是发育生物学研究的重要模式生物[11−14]。Liu等[12]研究了碳纳米管对果蝇存活率和运动行为的影响，发现成虫直接暴露于碳纳米管粉末后，运动能力下降且死亡率上升。

目前，检测量子点在活体组织及细胞内定位的手段主要有激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)、多光子显微镜、核磁共振等[15−17]。但是，利用LSCM检测量子点在生物体内分布还存在一定困难，如检测时通常会受到生物体自发荧光的干扰及生物体大小的限制(可适用于数μm的活体生物)；多光子显微镜分辨率略低，且费用昂贵。同步辐射微束X射线荧光分析(μ-SRXRF)具有检出限低(50–100 ng/g)、空间分辨率高(0.5–1 µm)及多元素检测等特点[18]。目前已用于纳米毒理学研究领域。Wang等[19]研究了Fe2O3纳米颗粒经嗅神经通路向脑组织中的转移，Gao等[20]研究了铜纳米颗粒在线虫体内的分布。

本文利用μ-SRXRF技术结合LSCM技术研究了果蝇成虫摄取量子点后，在暴露成虫和子代一期幼虫体内的转运和分布，测定了成虫体内的 Cd、Zn、Se元素，并对暴露成虫所产的一期幼虫进行LSCM成像分析，探讨量子点从果蝇母体转运到子代的能力。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

激光扫描共聚焦显微镜(美国PerkinElmer有限公司)；荧光倒置显微镜(Olympus IX71, 美国Olympus有限公司)；高功率数控超声波清洗器(KQ-500KDE, 昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(Acculab ALC-210.4, 北京赛多利斯科学仪器有限公司)；涡旋仪(CS-H1型，北京博励阳科技公司)；移液器(P型, 北京吉尔森科技有限公司)；Milli-Q Integral 3水纯化系统；CdSe@ZnS纳米粉体，尺寸3 nm，购于天津游瑞量子点有限公司；动物为w1118突变体果蝇。

1.2 实验方法

1.2.1 染毒培养基的制备

称取一定量的 CdSe@ZnS量子点配制成浓度为100 μg·g–1的水溶液，超声分散1–2 h。取果蝇标准培养基1.8 g于空的玻璃管中，微波炉高火加热10 s后迅速加入超声好的 CdSe@ZnS量子点母液200 μL，涡旋混匀，制备成含有10 μg·g–1量子点的果蝇培养基，室温冷却后备用。

1.2.2 μ-SRXRF分析

收集新生未交配的雌、雄性果蝇各100只，分别暴露于含有10 μg·g–1CdSe@ZnS的培养基中，置于25ºC的恒温培养箱中(湿度为40%–60%、光照周期L:D = 14:10)，暴露5天。结束后收集果蝇成虫，置于CO2环境中将其麻醉，用超纯水多次清洗，用毛刷将其放到聚碳酸酯膜上(Maylar)，经液氮冷冻后，室温自然晾干，待μ-SRXRF分析用。

μ-SRXRF测量在上海光源BL15U实验站(中国科学院上海应用物理研究所)上进行。储存环电子束流能量3.5 GeV，最大束流强度300 mA，利用该实验站的10 keV单色X射线，光斑尺寸10 μm×10 μm，果蝇成虫扫描步长为20 μm×100 μm，单点扫描时间15 s。XRF能谱分析用Igor Pro 6.0软件包(美国Wave metrics公司)，所得各元素的特征X射线强度用康普顿散射强度归一，以消除样品厚度、样品不均匀性及光强变化等因素对计数的影响。

1.2.3 激光扫描共聚焦实验

果蝇暴露结束后，把雌雄果蝇转移到标准培养基中，进行交配试验。收集交配后所产子一代一期幼虫，用超纯水清洗，放在薄的盖玻片上，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察。

2 结果与讨论

2.1 CdSe@ZnS量子点的荧光谱

图1(a)为粒径 3 nm的CdSe@ZnS量子点的荧光显微谱，激发光为波长390 nm的紫外光，产生较强的绿色荧光，荧光峰值波长为520 nm，发射峰的半峰宽为33 nm，荧光强度高达2838。由图1(b)，CdSe@ZnS量子点颗粒为圆形，尺寸均一，并发出明亮的荧光，与其荧光光谱图相符。

图1 390 nm UV激发下CdSe@ZnS量子点(3 nm)荧光光谱图(a)和荧光显微镜照片(b)Fig.1 Fluorescence spectrum(a) and fluorescence image (b) of 3 nm CdSe@ZnS QDs under 390 nm UV.

2.2 CdSe@ZnS量子点的成虫体内分布

图2为暴露于CdSe@ZnS量子点的果蝇成虫体内的Cd、Se和Zn 微区分布。Cd、Se、Zn均富集于成虫尾部的肠道和生殖系统，这三种元素的共位性表明CdSe@ZnS量子点蓄积在这些部位。

2.3 CdSe@ZnS量子点经母体向子代的转运

图3为果蝇成虫摄取CdSe@ZnS量子点后，所产子代一期幼虫的LSCM成像图片。由图3(b)可见，果蝇成虫暴露量子点后，其一期幼虫体内可检测到明显的荧光；比较图 3(a)和3(c)，发现量子点主要富集于幼虫生殖系统(精巢)内。然而在未暴露量子点的空白对照组中，所产一期幼虫在激光扫描共聚焦显微镜下未观察到明显的荧光信号，表明CdSe@ZnS量子点能通过果蝇母体转运至子代。

图2 暴露于CdSe@ZnS量子点的果蝇成虫体内Cd、Se和Zn微区分布，由µ-SRXRF测得Fig.2 µ-SRXRF elemental mapping of Cd, Se and Zn in the CdSe@ZnS QDs-exposed adult drosophila.

图3 LSCM成像观察量子点在果蝇一期幼虫体内的分布(a) 一期幼虫的明场照片, (b) 一期幼虫的荧光照片, (c) 一期幼虫的结构图Fig.3 LSCM images of stage-1 larva produced by the CdSe@ZnS QDs-exposed drosophila parents.(a) light field image, (b) fluorescence image, (c) structure of the stage-1 larva

3 结语

利用µ-SRXRF结合LSCM成像技术研究了经口暴露的 CdSe@ZnS量子点在果蝇成虫及子代一期幼虫体内的微区分布。µ-SRXRF分析表明，果蝇成虫摄取CdSe@ZnS量子点后，量子点主要富集在肠道和生殖道部位。LSCM研究表明，暴露成虫所产一期幼虫的生殖部位(精巢)有明显的荧光增强信号。上述结果表明，量子点暴露对果蝇母体到子代的转运及生殖系统可能产生潜在的影响。同时，µ-SRXRF技术的应用也为纳米颗粒在活体内转运研究提供了很好的分析手段。

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