青龙衣中胡桃醌的研究进展

温文兵，刘淑萍

（河北理工大学 化工与生物技术学院，河北 唐山063009）

0 引 言

核桃青皮，中药称为青龙衣，是胡桃科植物胡桃楸的外果皮。其中含有含量较高的活性物质胡桃醌（5-羟基-1，4-萘醌）。青龙衣与其他组织相比具有以下特点：1）青皮脱落后，其中的活性成分胡桃醌会抑制其他作物的生长，甚至杀死其他作物。2）核桃青皮中的含量较树皮、叶中的含量高。孙墨珑[1]采用超声波法提取核桃楸中的胡桃醌，结果显示，各组织中的含量为：树皮中为0.131mg/g，青皮中0.229mg/g，叶中0.209 mg/g。3）青龙衣原料廉价，很多数地区为废弃物，充分利用其中的活性物质，可以有效地利用资源。

1 胡桃醌的稳定性研究

季宇彬等考察了不同干燥方法对青龙衣中胡桃醌的含量的影响，结果表明，温度越高，胡桃醌的含量越低，因此采用适当的烘干方法对胡桃醌的提取有重要的影响。同时，作者也考察了储存时间、采摘时期对提取的影响。结果表明，储藏时间越长，胡桃醌的含量越低，最佳采摘时间为八月份[2]。索绪斌等采用索式提取法提取核桃青皮中的胡桃醌，HPLC法检测含量，结果显示贮存年限对胡桃醌含量有很大的影响[3]。

表1 不同年份采集的样品中胡桃醌的含量

孙墨珑等对核桃楸乙醇提取物的稳定性进行考察，以胡桃醌的降解率为指标，考察了温度、pH、光照等因素。结果表明，温度越高，胡桃醌的降解率越大；pH在2和10时，降解率很大，在4-8之间较稳定；光照时间越长，降解率越大；并且整体上，外果皮部分较叶和树皮部分降解较大[4]。袁海舰对一系列物质对胡桃醌的稳定性影响，结果表明：H2O2、Na2SO3。吐温80对胡桃醌的消减率有一定的影响；随浓度的增加，胡桃醌的消减率加大；不同环境对胡桃醌的消减率也不相同，暗室避光为 65.17%，阳光下照射为83.81%，甲醇中为0.58%[5]。

2 胡桃醌的医学研究

孙墨珑介绍青龙衣对皮肤病、子宫脱垂、白细胞减少症有良好的临床疗效、且有一定得镇痛作用，其中的活性成分含有胡桃醌、粗萘醌鞣花酸和核桃多糖[6]。临床实验表明，胡桃醌在一定浓度下对牙周炎的治疗有很好的疗效[7]。张野平等研究了胡桃醌对S180细胞的影响，对P388，P388／ADR及HeLa细胞增殖的抑制作用和抑菌作用。结果显示，胡桃醌对S180细胞在3小时内影响很小，超过3小时后，随浓度的增加，S180细胞细胞存活率有明显下降；在一定浓度下，随时间延长抑制作用增强。胡桃醌对肿瘤细胞P388，P388／ADR及HeLa细胞增殖有明显抑制作用，特别是对于阿霉素产生耐药性的白血病细胞抑制效果较好。另外，应用Paperdisc方法证明，胡桃醌对许多革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用[8]。

胡桃醌对乳头状肿瘤的恶性转化的控制有明显的效果[9]。有证据证明胡桃醌具有诱导突变的作用并且能够致癌[10,11]。从山核桃楸中分离得到纯晶体胡桃醌进行医学研究，结果表明该物质具有对鱼、老鼠、兔子等动物有镇静作用，它使兔子耳朵血管、心脏冠状动脉膨胀，但它对狗的血压和心率没有影响，它还抑制小鼠肠和子宫的平滑肌的活动[12]。胡桃树中天然毒性物质胡桃醌，对培养液中人类细胞有不同程度的损伤作用。正常细胞对胡桃醌极其敏感，通过快速细胞凋亡和坏死而死亡。结果归纳为，胡桃醌对细胞有多种作用，包括DNA损坏、抑制转录、减少ph3蛋白质水平以及诱导细胞死亡[13]。

3 胡桃醌的生物活性研究

Guntram R von Kiparski等[14]通过测定土壤中胡桃醌浓度，说明核桃树释放的胡桃醌超过土壤中微生物和非生物的降解率，土壤中会有胡桃醌的积累，但这不意味着胡桃醌的浓度会不断增加，因为微生物的活性也因此增加，使得降解率升高。Sheng-Hao Chao等研究了胡桃醌对Pin1酶有一定的抑制作用，通过阻止RNA聚合酶Ⅱ的形成中断转录。由于胡桃醌特异的抑制作用，其有希望用于体外转录研究[15]。通过水溶液培养液毒性测试，说明了胡桃醌对某些植物有潜在的毒性作用[16]。它在培养液中表现出毒性，具有抗病毒、抗细菌、抗真菌的性质[17]。胡桃醌的毒性活动模型包括醌基和酚基官能团对亲核试剂的电子反应活性以及具有能够承受氧化还原能力的醌基和酚基[18]。

源自胡桃楸的胡桃醌从树上到土壤的过程中，最初形态是相对无毒的α-羟基胡桃醌配糖，然后快速氧化成胡桃醌[19]。从胡桃楸中配糖物到胡桃醌分为两步，土壤中β-葡萄糖甘酶催化水解成羟基胡桃醌，再快速氧化成醌型胡桃醌[20,21]。

4 青龙衣的化学成分

青龙衣中化学成分很多，不同的提取方法提取出的化学物质不同。有机溶剂萃取方法，按类别划分，青龙衣中含有萘醌类、酮类、醛类、酸类、醇类、呋喃等物质。高小宁[22]用80%的乙醇回流提取青龙衣，通过反复硅胶层析、聚酰胺柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱分离得到9种化合物。β-谷甾醇、胡桃素、胡桃醌、核桃酮、胡桃酮、3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸、香草酸、山萘酚、槲皮素。经GC-MS联用技术表明了核桃青果皮氯仿、乙酸乙酯萃取相的化学组分。氯仿相得到 15种化合物，其中胡桃醌的含量最大，占到27.11%。按化合物种类分含有酯类5种，酚类3种，酮类2种，萘醌、呋喃、醇、醛、酸各1种。乙酸乙酯相得到24种化合物，其中，胡桃醌的含量最大，达到31.20%[23]。刘全宇[24]以95%乙醇回流提取青龙衣， H-NMR、C-NMR、IR等分析方法鉴别，确定5种化合物。分别为二十九烷醇、正三十一烷醇、正三十二烷醇、β-谷甾醇、D一葡萄糖。

5 胡桃醌的纯化研究

袁海舰[5]用乙醇提取的浸膏分别用乙酸乙酯和氯仿萃取，通过铺设薄层硅胶板，样品跑板、展开剂展开，刮取与胡桃醌标准品相同Rf值的部分，经HPLC分析，确定两部分都有很高的纯度。核桃楸的干燥青果皮经80%乙醇提取，用氯仿萃取。萃取相以硅胶拌样干法上样，过80-120目的硅胶柱，石油醚、乙酸乙酯、甲醇按比例梯度洗脱，薄层检识，合并馏分。其中一馏分经200-300目硅胶柱层析、洗脱，再经Sephadex LH-20凝胶柱纯化得到胡桃醌纯品120mg[22]。孙墨珑[1]从核桃楸树皮中提取胡桃醌，采用超声波辅助浸提、减压蒸馏和物理方法分离，重结晶得到纯品胡桃醌，得率为0.09%，纯度高达96.42%。

天然活性物质与化学合成品的纯化问题有所不同。首先，从植物或动物中提取的化合物化学成分很多情况下成分未知或者不稳定，难以用排除法提纯物质。其次，提取多是采用溶剂提取或利用其他辅助手段如震动、回流、微波加热等方式，这样，粗品中相似结构物质必然提取出来，利用化学性质很难纯化。由于以上因素，大多天然活性物质多采用各种色谱方法进行纯化。

6 胡桃醌的检测方法

索绪斌等[3]采用高效液相色谱法对青龙衣中胡桃醌进行经检测。固定相为定相为Shimpack-ODS反相色谱柱，流动相为甲醇-5%磷酸二氢钠（3:1）。该法灵敏度高、准确、重现性好，加样回收率为97.12%，RSD为1.17%。李福荣等[25]建立了HPLC法测青龙衣中胡桃醌的含量，使用Waters symmetry shieldTM RP18色谱柱，甲醇一水为流动相进行梯度洗脱，在1～150g范围内线性关系良好，当信噪比S／N= 10.04时，胡桃醌标准溶液定量限为5ng。孙墨珑等[26]建立分光光度法测定核桃树皮中胡桃醌的含量。用甲醇溶解样品，426nm下检测，利用标准曲线法得到样品含量。该方法加样回收率为99.6%，简单易行，测定准确。孙墨珑等[27]通过减压蒸馏等手段从核桃楸树皮中提取分离出胡桃醌，经GC-MS联用分析得到胡桃醌相对含量高达96.42%。GC-MS采用了DB-17MS型毛细管色谱柱，气化室温度260℃，EI电离源。孙墨珑[28]报道，对于单体成分的含量一般可用薄层扫描法测定，由于植物成分复杂，干扰比较大，很难达到完全分离的效果。伊朗学者Hadjmohammadi等[29]建立了RP-HPLC（反相高效液相色谱法）测定枫杨属白蜡叶枫杨的叶和壳中胡桃醌的含量。采用C18色谱柱，流动相乙腈浓度为50%，磷酸盐缓冲溶液pH为4，柱温为30℃，流速1.5m l/min。在浓度0.015～0.240mg/m l范围时，相关度分别为0.992和0.999，利用方程式计算得紫外检测器的检测限为1.03×10-4。

随着癌症治疗呼声的不断升高，研究抗肿瘤药物成为众多科学家的研究对象。胡桃醌在医学上的重要作用，特别是抗肿瘤作用，已成为目前的研究热点。与此同时，从胡桃植物中，特别是从青龙衣中提取分离高纯度的胡桃醌也成为很多学者研究的热点课题。

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