N-酚噻嗪丙磺酸的合成及其对HRP-Luminol-H2O2化学发光的增强作用

仇益民,汪 萍,李其华,冯志明，阎政礼，雷春华

（1.长沙市开福区人民医院，湖南 长沙410005；湖南师范大学化学化工学院，湖南 长沙410081）

1977年,Halman首先将化学发光应用于免疫分析,创建了化学发光免疫分析，目前它已成为发展最快和应用广泛的免疫分析方法。与传统的放射免疫分析RIA比较，化学发光免疫分析不需建立昂贵的放射性同位素实验室，没有放射性污染,不会对人体产生损害,且操作简便。与酶联免疫分析ELISA比较，化学发光免疫分析不仅灵敏度高,而且能较好进行定量免疫分析与检测。

辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)是增强化学发光酶免疫分析常用的标记体系,因其具有高转换系数、对不同灵敏度分析系统的适应性及适用不同的联接方法和相对分子量小等特点而被广泛应用。鲁米诺luminol是HRP催化氧化发光的常用底物。如果不使用增强剂,鲁米诺体系的发光基本上为闪光型,且信号弱、灵敏度低。但通过加入增强剂,可使发光时间明显延长,使其从短暂的闪光型改进为持续30 min至数小时甚至更久的辉光型，明显增强信号强度和提高信噪比、灵敏度，简化操作和测量方法[1]。用于HRP酶促化学发光的增强剂非常广泛,包括荧光素、取代酚、对羟基联苯、芳香胺、取代硼酸和靛酚等[1,2]。

本文拟合成N-酚噻嗪丙磺酸，探讨N-酚噻嗪丙磺酸对HRP-Luminol-H2O2化学发光的增强特性，并用于HRP含量的测定。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 ；pHS-25型酸度计 上海精密科学仪器有限公司；Avance-500 FT-NMR谱仪瑞士Bruker公司，TMS为内标，D2O为溶剂,耦合常数(J)以Hz为单位；Nicolet-550 FT-IR型红外光谱仪 美国Nicolet公司 溴化钾压片；PE-2400元素分析仪 美国PE公司；LKB-1250发光光度计(瑞典)。

酚噻嗪、1,3-二溴丙烷、鲁米诺和辣根过氧化物酶(美国Sigma公司)；其它化学试剂均为分析纯。层析硅胶粉(青岛海洋化工厂)200-300目。

1.2 N-酚噻嗪丙磺酸的合成

9.2 g (0.05 mol)酚噻嗪溶于30 mL无水四氢呋喃，缓慢加入2.4 g 0.1 mol NaH溶于30 mL无水四氢呋喃，在避光、N2保护和50℃下搅拌反应2 h制得酚噻嗪N钠盐。冷至室温后，缓慢滴入10.1 g 0.1 mol 1,3-二溴丙烷 溶于30 mL无水四氢呋喃，在避光、N2保护和室温下搅拌反应24 h。滤除残渣后的反应液经真空浓缩所得固体经硅胶 (200-300目)柱层析分离正己烷-苯为洗脱液。洗脱液真空浓缩至干，残渣用无水乙醇重结晶2次，60℃真空干燥24 h得5.1 g暗绿色色固体化合物N-酚噻嗪溴丙烷收率33.5%。N-酚噻嗪溴丙烷溶于10 mL四氢呋喃，加入适量饱和亚硫酸氢钠溶液，避光搅拌回流反应4 h。减压回收四氢呋喃，真空浓缩所得固体经乙醇重结晶制得N-酚噻嗪丙磺酸钠。

1.3 HRP-Luminol-H2O2化学发光体系

将适量的N-酚噻嗪丙磺酸溶液(3.43 mg溶于1 mL pH 8.5 T ris缓冲液)、辣根过氧化物酶溶液(用 pH 8.5 Tris缓冲液稀释至 1×10-7g/L和 3.0 mmol/L H2O2溶液加入到测定管中,再加入适量鲁米诺溶液 17.7 mg溶于1 mL pH 8.5 Tris缓冲液后在发光光度计中测定发光强度。

2 结果

2.1 N-酚噻嗪丙磺酸的结构表征

N-酚噻嗪丙磺酸钠的收率65.6%3.6 g。1H NMR(D2O/TMS)δ:2.0(t,2H,-CH2CH2CH2SO3Na),2.5 (t,2H,CH2N),4.0 (t,2H,CH2N),6.5-7.6(m,8H, PhCH2).IR (KBr) : 3058, 2985, 1630, 1589，1456，1106，643 cm-1。N-酚噻嗪丙磺酸钠(C15H14NS2O3Na)的元素分析结果 (计算值):C 52.45(52.50),H 4.12(4.17),N 3.92 4.08。

2.2 N-酚噻嗪丙磺酸对HRP-Luminol-H2O2酶促发光的增强作用

在HRP-Luminol-H2O2反应体系 1.0×10-8g/L HRP,0.01 mmol/L Luminol,0.3 mmol/L H2O2中,无增强剂时，发光强度低，且持续时间仅为数秒至十几秒。加入1.0×10-3mmol/L N-酚噻嗪丙磺酸对可以显著地增强HRP酶催化的化学发光强度，延长发光可持续约30 min以上,之后缓慢衰减 表1，说明N-酚噻嗪丙磺酸对HRP-Luminol-H2O2反应体系的发光具有显著的增强作用。加入N-酚噻嗪丙磺酸后，克服了传统的HRP-Luminol-H2O2反应体系瞬时发光,发光强度低，持续时间短，不易准确测量等弱点[3-4]。

表1 N-酚噻嗪丙磺酸对HRP-Luminol-H2O2酶促发光的增强效应相对发光强度

2.3 N-酚噻嗪丙磺酸的浓度对HRP-Luminol-H2O2化学发光的影响

在HRP-Luminol-H2O2反应体系 1.0×10-8g/L HRP，0.01 mmol/L Luminol，0.3 mmol/L H2O2中,依次加入不同剂量的N-酚噻嗪丙磺酸，记录30 s时的发光强度表2。N-酚噻嗪丙磺酸浓度在0.5-64 mmol/L范围内，显示较好的增强效果。在HRP浓度为1.0× 10-8g/L时，加入1.0×10-3mmol/L N-酚噻嗪丙磺酸即可获得理想的增强效果。也提示在酶浓度更低时可适当选择较高浓度的增强剂，以提高检测的灵敏度。

表2 N-酚噻嗪丙磺酸的浓度对HRP-Luminol-H2O2酶促发光的作用

2.4 对HRP酶含量的测定

HRP采用0.1%BSA溶液应用对数稀释法,浓度依次为每mL含1600,800,400,200,100,50, 25 pg。在HRP-Luminol-H2O2反应体系 0.01 mmol/ L Luminol，0.3 mmol/L H2O2中,依次递增辣根过氧化物酶含量,30 s秒记录得到发光值 表3。

表3 酶浓度对HRP-Luminol-H2O2酶促发光的作用

在发光体系中加入N-酚噻嗪丙磺酸，酶含量在25-800 pg/mL范围内HRP含量与发光相对强度显示良好的线性关系，可显著降低最低检测限量，提高检测灵敏度。

3 讨 论

HRP标记抗体方法成熟稳定,用于增强化学发光系统中具有样品用量少,反应时间短,发光强度大,无污染等优点，应用广泛。

在HRP-Luminol-H2O2反应体系中加入N-酚噻嗪丙磺酸后，其最大发射波长仍为425 nm处，与文献报道HRP-Luminol-H2O2反应体系发光光谱相同。说明N-酚噻嗪丙磺酸没有改变HRP酶促发光反应的历程,可能是增强剂直接或间接加速了发光反应的一步或多步复合物形成的过程。催化反在HRP-Luminol-H2O2反应体系中，增强剂N-酚噻嗪丙磺酸的使用从其稳定性及增强发光作用等都显示出较好的性质,经多次试验未发现变异现象,重复性好。不同于酚类有机增强剂[5]，N-酚噻嗪丙磺酸易溶于水，使用方便，在灵敏度、精密度和准确性等表现了较好的优越性,有望应用于HRP及其标记物的发光检测如ELISA和West-blotting等免疫分析中。

[1]Sánchez FG,Díaz AN,Bracho V,et al.Automated determination of asulam by enhanced chemiluminescence using luminol/peroxidase system [J].Luminescence,2009,24(6): 448-52.

[2]舒立涛,徐宝顺,张培因.增强化学发光酶免疫分析法建立及测定血清中的胃泌素 [J].中国实验诊断学,2006,10 (1):96-97.

[3]Minekawa T,Ohkuma H,Abe K,et al.Development of ultra-high sensitivity bioluminescent enzyme immunoassay for hepatitis B virus surface antigen using firefly luciferase [J].Luminescence,2009,24(6):394-399.

[4]Alpeeva IS,Yu Sakharov I.Luminol-hydrogen peroxide chemiluminescence produced by sweet potato peroxidase [J].Luminescence,2007,22 2:92-96.

[5]Xin TB,Chen H,Lin Z,et al.A secondary antibody format chemiluminescence immunoassay for the determination of estradiol in human serum[J].Talanta,2010,82(4):1472-1477.