血管内皮抑素联合肝动脉化疗栓塞对大鼠肝癌移植瘤组织血管生成的影响*

张宝南,魏治鹏

无锡市中医医院肿瘤科无锡 214001

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤,肝动脉化疗栓塞术(TACE)是常见的中晚期肝癌的重要治疗手段,但TACE很难达到手术治疗效果,复发和转移是影响长期疗效的主要原因[1]。患者TACE后检测的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平往往升高,提示肿瘤周围血管形成和侧支循环建立[2],因此抗肿瘤血管生成治疗有可能改善TACE的疗效。血管内皮抑素是抗血管生成代表药物,能特异性作用于新生血管内皮细胞,对抗VEGF的促血管生成而发挥作用[3-4]。作者建立雄性成年Wistar大鼠肝癌移植瘤模型,采用重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin,YH-16)联合TACE进行治疗,观察肿瘤组织内VEGF的表达和微血管密度(microvessel density,MVD),了解YH-16在抗肿瘤血管生成中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物 40只雄性成年Wistar大鼠(体质量180～250 g)和5只传种Wistar幼鼠均购自上海中国科学院细胞所动物房。Walker-256瘤株购自上海医药工业研究院。鼠抗人VEGF免疫组化试剂盒购自美国Lab Vision公司(上海晶美生物工程有限公司代理),兔抗人CD34单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。阿霉素购自深圳万乐药业有限公司,超液化碘油购于法国Cuerbet公司。YH-16由江苏先声药业有限公司提供,15 mg(3 mL/支),4℃冰箱贮藏,避免剧烈振荡。

1.2 栓塞剂配制 阿霉素碘化油乳剂制备:取阿霉素50 mg+超液化碘油10 mL充分乳化;YH-16-阿霉素碘化油乳剂制备:取YH-16 30 mg混入阿霉素碘化油乳剂中充分乳化。

1.3 大鼠肝癌移植瘤模型的建立 无菌条件下,将瘤株从液氮中复苏并增殖至4×106m L-1,注入传种大鼠腹腔,1周后大鼠出现癌性腹水,抽出癌性腹水0.5～1.0mL注入另一只大鼠皮下,1周后皮下长出1 cm3大小实体瘤,将荷瘤大鼠处死,无菌条件下取出实体瘤,局部消毒,去除纤维组织,挑选无出血、坏死肿瘤组织,切成2mm×2 mm×2 mm备用。另取大鼠40只,以戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉,大鼠取仰卧位,四肢固定于手术板上后,术区用体积分数为75%乙醇消毒,腹正中切开皮肤1.0 cm左右,用显微组织镊子将肝包膜戳一小口,将肿瘤块沿隧道嵌入,明胶海绵堵塞窦口,完毕后逐层缝合腹壁,饲养待用。术后肌内注射庆大霉素40 kU/d预防感染。

1.4 分组与处理 采用随机数字表将40只造模成功大鼠分为对照组与观察组,各 20只,再次麻醉后固定,剖腹暴露肝脏,分离胃十二指肠动脉、肝动脉及肝固有动脉,结扎胃十二指肠动脉远端,以银夹暂时阻断肝总动脉,于手术显微镜下在胃十二指肠动脉上切一小口,插入特制微导管,上行进入肝固有动脉,待回血后,对照组大鼠肝动脉内注入 2～3 m L/ kg阿霉素碘化油乳剂,观察组给予2～3mL/kg YH-16-阿霉素碘化油乳剂,灌注后拔管,结扎胃十二指肠动脉近端,开放肝总动脉,逐层缝合切口后擦净伤口,外涂金霉素软膏,分笼、恒温、自动供水供食饲养。7 d后处死所有大鼠,剖腹留取肿瘤组织,备用。

1.5 VEGF和MVD的免疫组化检测 组织标本常规脱水,石蜡包埋,4μm连续切片,采用SABC法进行免疫组化染色。VEGF一抗工作浓度为1∶200,MVD一抗工作浓度为1∶50。以PBS替代一抗作阴性对照。VEGF表达以细胞质内出现浅黄色、棕黄色或褐黄色颗粒为阳性。高倍镜下每张切片采用图像分析仪选取 5个视野,每视野计数 100个细胞,计算阳性细胞百分率。参照Weidner方法并加以改进进行微血管计数,凡是染成棕色的单个内皮细胞或内皮细胞成簇出现,并与相邻血管、肿瘤细胞以及间质成分相分隔的,作为一个微血管计数;首先在低倍镜下观看全片,寻找肿瘤内血管清楚且微血管数最多的区域,然后在高倍镜下计数这一视野的微血管数[5]。

1.6 统计学处理 用SPSS 12.0进行分析,采用两独立样本t检验比较2组癌组织中VEGF的表达和MVD,检验水准α=0.05。

2 结果

移植瘤组织中VEGF和MVD检测结果见图1、表1。

图1 2组大鼠移植瘤组织中VEGF(A)和MVD(B)的表达1:对照组;2:观察组。

表1 2组癌组织中VEGF和MVD的检测结果

3 讨论

血管内皮抑素被视为抗肿瘤血管生成治疗中最具前途的药物之一,能封堵VEGF受体VEGFR-1 (Flk-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和VEGFR-3(Flk-4),阻断VEGF介导的信号传导;阻止血管内皮细胞与VEGF的结合,下调VEGF mRNA和蛋白表达,从而抑制VEGF介导的内皮细胞迁移和血管生成。其抑制血管内皮细胞增殖能力是已发现的血管抑制素的数倍,且作用与剂量呈正相关,不抑制其他细胞的生长,无化疗药物的毒副作用[2,6-9]。

通过介入治疗中的导管技术将化疗药物送达肿瘤供血动脉可延长药物和肿瘤细胞的接触时间,提高局部的药物浓度,减少全身反应[10]。单纯的TACE主要针对已经生成的肿瘤血管,对新生的血管无栓塞作用;而血管内皮抑素主要抑制肿瘤新生血管,对于已经形成的血管作用不大。二者联合可以互补,在阻断肿瘤供血的同时抑制新生血管的生成,从而达到致肿瘤坏死同时抑制新生肿瘤的复发、转移的作用[11]。

作者的实验结果显示,与对照组相比,观察组大鼠Walker-256肝癌移植瘤组织内VEGF的表达和MVD表达下降,提示YH-16使肿瘤新生血管的形成明显减少,YH-16联合TACE可有效对抗血管生成。

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