菟仙海蚣胶囊对生精细胞损伤大鼠睾丸生精功能保护作用研究

张银川,刘喜平

(1.定西市妇幼保健院,甘肃定西 743000;2.甘肃中医学院,甘肃兰州 730000)

少精、弱精症是造成男性不育或生育力下降的主要原因,菟仙海蚣胶囊来源于笔者治疗少精、弱精男性不育症的验方,由菟丝子、仙灵脾等 5味药物组成。临床应用表明,菟仙海蚣胶囊可增加少精、弱精患者精子密度、提高精子活力[1]。本研究观察了菟仙海蚣胶囊对腺嘌呤致生精细胞损伤大鼠睾丸生精功能的保护作用,以期揭示其作用机制,为临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SD大鼠,SPF级,雄性,3个月龄,体质量280～320 g,由甘肃中医学院科研实验中心提供,动物实验设施使用证号SYXK(甘)2004～0006,实验动物质量合格证号SCXK(甘)2004～0006。动物分笼饲养,食固体 SPF级饲料,自由饮水。饲料由北京市科奥协力饲料有限公司提供,合格证号为京动许字(2000)第 015号。室温 20～25℃,相对湿度45%～52%。

1.2 药品、试剂与仪器

菟仙海蚣胶囊由菟丝子、仙灵脾等 5味药物按一定比例组成,由兰州中药现代化工程技术中心及甘肃中医学院科研实验中心监制,规格为0.35 g/粒(3.21 g生药/g胶囊),实验室时用生理盐水配置成相应浓度的溶液。五子衍宗丸,北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂产品,批号 2009324。羧甲基纤维素钠,河北省文安县盛源纤维素厂产品,批号20090227;腺嘌呤,洛阳德胜化工有限公司产品,批号20080911;一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS),均为南京建成生物工程研究所产品,批号依次为 090612,090510;戊巴比妥钠,中国医药集团上海化学试剂公司产品,批号 20030816。Tissue-Tek·VIPTM5Jr全封闭组织脱水机、Tissue-Tek·TECTM5组织包埋机及IVS-40推拉式切片机,均为日本樱花电器株式会社产品;BH-2显微镜,日本OLYMPUS产品;R-200旋转蒸发仪,瑞士BUCHI产品;BL150电子天平,北京Sartorius产品; KDC-2044低速冷冻离心机,科大创新股份有限公司中佳分公司产品。

1.3 动物分组与给药

方法[2],将 72只 SD雄性大鼠适应性喂养 3～4 d后,随机分为空白对照组、模型对照组、五子衍宗丸组及菟仙海蚣胶囊大、中、小剂量组 6组,每组 12只,分笼饲养,每笼 6只。空白对照组每天灌胃0.5%羧甲基纤维素钠10μL/g;模型对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠5μL/g,40min后灌胃5%的腺嘌呤混悬溶液(250μg/g)5μL/g;五子衍宗丸组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠5μL/g,40 min后灌胃24%的五子衍宗丸溶液5μL/g;菟仙海蚣胶囊大剂量组每天灌胃中药浸膏5.4 g生药/kg, 40min后灌胃5%的腺嘌呤混悬溶液(250μg/g) 5μL/g;菟仙海蚣胶囊中剂量组每天灌胃中药浸膏2.7 g生药/kg,40 min后灌胃5%的腺嘌呤混悬溶液(250μg/g)5μL/g。菟仙海蚣胶囊小剂量组每天灌胃中药浸膏1.35 g生药/kg,40min后灌胃5%的腺嘌呤混悬溶液(250μg/g)5μL/g。每天1次,实验总持续时间为40 d。实验期间每 7 d称体质量1次,调整给药量,每天每 100 g体质量大鼠的给药总量为1mL。

1.4 检测指标

1.4.1 睾丸组织形态学的变化及其损伤评分

将睾丸以10%甲醛液固定,石蜡包埋,切片,制片,脱腊,HE染色,封片。于光镜下观察曲精细管结构、计数生精上皮数、测量MSTD并显微摄影,参考文献方法[3],对睾丸组织结构进行评分。

1.4.2 睾丸组织NO与NOS变化

取一侧睾丸,将睾丸表面的白膜去除;剪取0.3 g放于预先消毒过的平皿中;加入预冷的匀浆介质(0.01 mol/L Tris-HCl)共2 mL,用眼科小剪刀尽量剪碎组织,转移至匀浆器制备匀浆;以另外1m L匀浆介质冲洗并转移匀浆后的组织溶液置于一次性试管中,制成约10%(W/V,即0.1 g组织加1m L介质)的组织溶液;10 000 r/min低温离心30min;取上清液按照试剂盒说明书用硝酸还原酶法检测NO、NOS活性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数(BZ_139_2138_999_2156_1045)±标准差(s)表示,组间比较采用t检验。以 P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 菟仙海蚣胶囊对生精细胞损伤大鼠一般情况的影响

空白对照组大鼠精神、体征正常。模型对照组除 1只大鼠在造模灌胃过程中因操作不当而死亡外,其余大鼠出现明显的肾阳虚症状如精神萎靡、蜷卧、反应迟钝、少动、进食减少、竖毛、眯眼、眼睑周围浮肿、耳廓苍白、多尿等,且随给药天数的增加而加重。菟仙海蚣胶囊大、中、小剂量组大鼠体征较模型对照组为轻。

2.2 菟仙海蚣胶囊对生精细胞损伤大鼠睾丸组织病理形态学及损伤评分的影响

空白对照组睾丸组织曲细精管各级生精细胞发育正常、排列规整。模型对照组睾丸呈萎缩状态,部分曲细精管退化变性,管腔内生殖上皮变薄,各级生精细胞数量减少。菟仙海蚣胶囊大剂量组异常曲细精管明显减少,精子细胞较多见。五子衍宗组及菟仙海蚣胶囊中、小剂量组在低倍镜下见典型的“斑点样”改变;在高倍镜下见部分曲细精管萎缩,精原细胞和支持细胞明显减少,部分精子间质水肿,间质细胞空泡样变性。见图 1。

图1 各组大鼠睾丸组织病理学HE染色切片(×200)

睾丸组织损伤评分结果见表 1。给予腺嘌呤溶液 40 d后,模型对照组睾丸与空白对照组在生精上皮层数、MSTD、睾丸组织结构评分上差别有统计学意义(P＜0.01);菟仙海蚣胶囊大剂量组在生精上皮层数、MSTD和组织结构评分上与模型对照组对比,差别有统计学意义(P＜0.01)。

表1 各组大鼠睾丸组织损伤评分对比 ±s

表1 各组大鼠睾丸组织损伤评分对比 ±s

注:与空白对照组对比,**P＜0.01;与模型对照组对比,#P＜0.05,##P＜0.01。

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2.3 菟仙海蚣胶囊对生精细胞损伤大鼠睾丸组织NO及NOS的影响

见表3。模型对照组睾丸组织匀浆中NOS活性增强,NO含量增加,与空白对照组对比,差别有统计学意义(P＜0.01);菟仙海蚣胶囊大、中、小剂量均能对抗该效应,与模型对照组对比,差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。表明菟仙海蚣胶囊具有降低睾丸织中异常升高的NOS活性、NO含量的作用。

表2 各组大鼠睾丸组织NO及NOS含量对比 ±s

表2 各组大鼠睾丸组织NO及NOS含量对比 ±s

注:与空白对照组对比,*P＜0.05,**P＜0.01;与模型对照组对比,#P＜0.05,##P＜0.01。

组 别剂量/g·kg-1 动物数NO /mmol·g-1 NOS /U·mg-1空白对照组 — 12 3.18±0.47 3.81±0.54模型对照组 0.25 11 5.96±0.70** 5.43±1.09**五子衍宗组 1.2 12 3.92±0.90## 4.59±0.89#菟仙海蚣大剂量组 5.4 12 3.87±0.55## 4.22±0.69#菟仙海蚣中剂量组 2.7 12 5.34±0.61# 4.62±0.67#菟仙海蚣小剂量组 1.35 12 5.66±0.68 4.99±0.79#

3 讨 论

男性少精、弱精症是造成男性不育或生育能力低下的重要原因,其病因复杂,尤其是特发性的精子减少或特发性弱精子原因不明。中医学认为“肾藏精”、“主生殖”,肾之阴精是化生精液的物质基础,其化生过程又赖肾阳的气化作用,气血条畅是肾之阴阳正常升降的前提。故肾虚精瘀是男性少精、弱精症的重要病机,温肾益精、活血通精法为其防治的基本治法。菟仙海蚣胶囊由菟丝子、蜈蚣等药物组成,组方严谨,药少力专,能温肾益精、活血通精,使精出有源、精行通畅。腺嘌呤可诱导肾阳虚型睾丸功能损害[4],故本研究选用腺嘌呤建立大鼠生精细胞损伤动物模型。实验结果显示,给予腺嘌呤溶液后大鼠出现明显的肾阳虚症状,菟仙海蚣胶囊可改善大鼠肾阳虚症状。

睾丸是性腺轴的靶器官,是精子发生的场所,睾丸曲细精管及间质细胞等组织的损伤,可导致生殖内分泌激素水平降低,并影响精液的数量与质量。本研究表明,经菟仙海蚣胶囊干预后,睾丸组织萎缩状态得到一定程度的改善,异常曲细精管明显减少,精原细胞和支持细胞较模型对照组明显增多,精子细胞较多见。

精子发生是由分化较低的精原细胞发育成为高度分化精子的过程。NOS和NO对男性生殖功能具有重要调节作用,可调节睾丸的血液供应、激素的合理分泌,参与支持细胞、精子的正常发生及获能,并影响精子的质量,从而影响男性的生殖功能。此外,低浓度的NO可促进精子活力、保护精子功能,而高浓度的NO则有抑制作用,可导致生精障碍,引起不育[5]。本研究表明腺嘌呤可诱发大鼠睾丸组织中NOS活性增强、NO含量增加,菟仙海蚣胶囊具有降低睾丸织中异常升高的NOS活性和NO含量的作用,从而促进精子活力、保护生精功能。

参考文献:

[1]张银川,徐瑛瑛,李蕊娜,等.菟仙海蚣胶囊治疗少精、弱精症的临床观察[J].甘肃中医,2010,23(4):37-38.

[2]杨阿民,李曰庆,李海松,等.补肾生精丸对腺嘌呤所致生精细胞损伤模型大鼠的干预作用[J].北京中医药大学学报:中医临床版,2006,13(3):1-3.

[3]林孝坤,秦乐,陈肖鸣.环孢素对大鼠睾丸生精功能自身免疫反应损伤的保护作用[J].温州医学院学报,2009, 39(2):101-103.

[4]傅晓晴,林若勤,武一曼,等.腺嘌呤制作肾阳虚型慢性肾功能衰竭模型大鼠的生化研究[J].福建中医学院学报,2003,13(1):22-24.

[5]康友敏,张健,李健,等.睾丸内 NO与NOS的研究进展[J].军事医学科学院院刊,2002,26(4):301-304.