四逆散干预实验性溃疡性结肠炎的药效学研究 *

王丽娜,范 颖,卢 健,林庶茹

(1.辽宁中医药大学方剂教研室,辽宁沈阳 110032;2.辽宁中医药大学中医分子生物学实验室,辽宁沈阳 110032)

四逆散近年来被广泛应用于消化系统疾病如内滞不通引起的胸胁苦满、腹中胀痛或下利等的治疗。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)表现为腹痛、腹泻、大便带血,甚或黏液脓血便、里急后重等,属于中医学“泄泻”、“痢疾”、“滞下”等范畴,与四逆散治疗病证相符。目前有关四逆散原方治疗UC的实验研究尚未见报道。本实验旨在探讨四逆散对实验性UC大鼠的药效学影响,以期初步揭示其干预实验性UC的机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级SD大鼠40只,体质量160～180 g,雌雄各半,一次性购于上海西普尔 -必凯实验动物有限公司,合格证号为SCXK(沪)-20080016。

1.2 药品、试剂与仪器

四逆散组由柴胡免煎颗粒(批号0909165)、白芍免煎颗粒(批号0909053)、枳实免煎颗粒(批号0909086)、炙甘草免煎颗粒(批号 0909050)组成,均由江阴天江药业有限公司提供;固肠止泻丸由西安阿房宫药业有限公司提供(批号092440),为中药对照药。多聚甲醛,国药集团化学试剂有限公司产品,批号F20090722;完全弗氏佐剂,美国SIGMA公司产品,批号096K89031;生理盐水;75%酒精;PBS缓冲液等。BL610型电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司产品;飞鸽牌TDL-5-4型离心机,上海安亭科学仪器厂产品;DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机,宁波新芝生物科技股份有限公司产品;OLYMPUS显微镜,日本TKO光学仪器株式会社产品; RM2145型切片机及 H 11210型烤片机,均为德国徕卡仪器有限公司产品。

1.3 模型的建立

参照文献方法[1]加以改良。取新鲜家兔的结肠黏膜制成黏膜匀浆,冷冻24 h;溶冻后以4 000转/min的速度离心30 min;取上清液提纯,根据Low ry法测定蛋白含量;含量达标后置于冰箱保存备用;使用时与等量完全弗氏佐剂配成抗原乳化液。除正常对照组外,其余每组于造模第 1天注射抗原乳化液,分别注射于大鼠的双侧足跖、双侧腹股沟及背部,每只0.5 m L;第10,17 d依同法注射等量抗原乳化液。

1.4 分组与给药

按体质量将 40只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、固肠止泻丸组、四逆散组4组,每组 10只,雌雄各半。各组均按 10μL/g体质量的浓度配备灌胃药物。正常对照组、模型对照组按1.00mg/(g·d)蒸馏水灌胃,其他两组造模同时于第 2天给予药物处理。各组药物按临床成人用量的 6.3倍折算实验大鼠的用量,分别为中药对照组按1.4 mg/(g·d)固肠止泻丸溶液灌胃,四逆散组按1.75mg/(g·d)四逆散溶液灌胃。

1.5 取材方法

于给药后 20 d处死大鼠,摘取动物脾脏、胸腺称量质量,并计算其脾脏、胸腺指数。取距肛门约10 cm处病变最明显结肠组织,沿肠系膜纵向剪开,以生理盐水冲净肠管壁,将结肠剖开、展平,使黏膜表面向上,对其进行肉眼观察,并按结肠黏膜损伤程度评分标准评分。于病变部位取材,置于 4%多聚甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋切片,HE染色,光镜观察,并且按照结肠病理组织学评分标准进行评分。

1.6 检测指标

1.6.1 一般情况

实验期间观察各组大鼠精神状态、活动度、毛色光泽度及疏密度、大便性状、饮食饮水情况、死亡情况等。记录大鼠体质量变化,每周称质量1次以调整给药量。

1.6.2 脾脏、胸腺指数

根据以下公式计算。脾脏指数(mg/10 g)=脾脏质量×100/体质量,胸腺指数(mg/10 g)=胸腺质量 ×100/体质量。

1.6.3 肉眼下结肠组织损伤程度

肉眼观察结肠黏膜损伤情况,按结肠组织形态学评分标准(见表 1)评定结肠黏膜损伤积分。

表1 结肠组织形态学评分标准

1.6.4 光镜下结肠组织损伤程度及形态学变化

病理切片观察用常规的HE染色法。光镜下观察结肠组织损伤情况,参考组织学损伤评分[3],包括溃疡炎症肉芽肿,纤维化有无、轻、重(有无、轻、重分别计为0,1,2分)及病变损害深度(至黏膜下层 1分,至肌层 2分,至浆膜层3分),各项相加即为总分。

1.7 统计学方法

采用SPSS 15.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数(BZ_139_2138_999_2156_1045)±标准差(s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 四逆散对UC大鼠一般情况的影响

造模前,各组大鼠精神状态良好,毛发紧密且有光泽,反应灵敏,较活跃,饮食饮水正常,大便正常。模型对照组大鼠出现形体消瘦,精神萎靡,有拱背、扎堆现象,毛发较疏松无光泽,肛周被污染,有不同程度的腹泻,部分大鼠可见肉眼少量血便。四逆散组及固肠止泻丸组大鼠的上述症状和体征有明显改善。

2.2 四逆散对UC大鼠脾脏指数、胸腺指数的影响

与正常对照组对比,模型对照组、固肠止泻丸组、四逆散组大鼠脾脏指数升高,差别有统计学意义(P＜0.01);模型对照组大鼠胸腺指数降低,差别有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组对比,固肠止泻丸组、四逆散组大鼠脾脏指数及胸腺指数均升高,差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。四逆散组与固肠止泻丸组两指标对比,差别无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组大鼠脾脏指数和胸腺指数对比mg·10-1·g-1,±s

表2 各组大鼠脾脏指数和胸腺指数对比mg·10-1·g-1,±s

注:与正常对照组对比,*P＜0.05,**P＜0.01;与模型对照组对比, #P＜0.05;##P＜0.01。

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2.3 四逆散对UC大鼠结肠组织损伤程度的影响

与正常对照组对比,模型对照组、固肠止泻丸组、四逆散组大鼠结肠组织损伤程度评分及病理组织学评分增高,差别均有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组对比,固肠止泻丸组、四逆散组大鼠结肠组织损伤程度评分以及结肠病理组织学评分降低,差别均有统计学意义(P＜0.01)。四逆散组与固肠止泻丸组两指标对比,差别无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。

表3 各组大鼠结肠损伤程度对比 ±s

表3 各组大鼠结肠损伤程度对比 ±s

注:与正常对照组对比,**P＜0.01;与模型对照组对比,##P＜0.01。

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2.4 四逆散对UC大鼠结肠组织形态学的影响

正常对照组大鼠结肠黏膜上皮细胞完整、连续,固有层腺体排列规整,无水肿、增生、充血,无溃疡、糜烂点及细胞浸润。模型对照组黏膜表面可见溃疡形成,重者可达肌层,炎症反应较重,有充血糜烂,细胞浸润,黏膜上皮部分缺失,局部固有层腺体减少,黏膜肌层不明显。固肠止泻丸组黏膜小凹变浅,固有层腺体减少。四逆散组黏膜层、黏膜肌层清晰,黏膜小凹正常。见图 1。

图1 各组大鼠结肠组织病理学HE染色切片(×100)

3 讨 论

有学者认为,脾脏指数和胸腺指数的改变能够反映机体免疫功能的状态[4-5]。有关 UC动物模型脾脏指数改变的报道不一,多数研究结果表明UC大鼠脾脏指数明显降低[6],亦有研究证明 UC大鼠脾脏指数增加[7]。本实验发现,模型对照组大鼠脾脏指数明显高于正常对照组,此可能是由于机体免疫功能紊乱,炎性细胞浸润,发生感染而致。经四逆散治疗后,UC大鼠脾脏、胸腺指数均显著升高,提示四逆散可能具有促进UC大鼠脾脏和胸腺免疫功能恢复的作用,亦验证了四逆散可正向调节免疫抑制状态机体的免疫功能,对机体免疫功能有促进和调节的作用[8]。

从结肠标本两大评分比较得出,模型对照组大鼠结肠损伤程度明显重于正常对照组,四逆散组大鼠的结肠损伤程度明显轻于模型对照组,差别均有统计学意义。观察UC大鼠结肠黏膜病理形态学发现,采用四逆散干预治疗后,病变组织黏膜层、黏膜肌层清晰,黏膜小凹正常,未见炎性渗出,说明结肠黏膜病变组织已得到有效的修复。由此可初步得出,四逆散能有效改善 UC大鼠的一般状况和病理损害,具有减轻 UC大鼠结肠炎性以及溃疡病变的效用。此亦验证了四逆散的抗溃疡作用[9-10]。

本实验证明,四逆散能够有效治疗实验性大鼠UC,其作用机理可能与提高UC大鼠的免疫功能、减轻UC大鼠病理损伤程度有关。卫生出版社,1991:1161.

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