东北林蛙油提取工艺优化的研究

余 琼，张 巍，杜 阳，杨旭升

(1.黑龙江大学生命科学学院微生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨150080；2.黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨150001）

东北林蛙及东北林蛙油是食、疗兼用的佳品，东北林蛙具有养肺滋肾，治虚劳咳嗽之功效，东北林蛙油具有“健脾胃、滋阴补肾、补虚退热，润肺生津，利水消肿”之功能，主治体虚气弱，气血亏损，脾胃虚弱，产后诸虚，肺瘩咳血，精力耗损，记忆减退，神经性头痛，眩晕、失眠，神经衰弱[1～5]。亦用于病后失调，产后无乳以及盗汗、水肿腹胀，疮疾，疮痛肿毒等症。

东北林蛙及东北林蛙油均可食用，其味美肉嫩，“肉味如鸡”，可烹制多种菜肴、汤菜，并可与人参、鹿茸等补品一起烹制。此外，尚可用其油做制豆浆、油糖，软糖等别具地方风味的高级补品。

东北林蛙油以油块肥厚、色黄白不带皮卵、无碎渣、白露到霜降产的最好。一等:黄白色，光亮，大厚片，不带皮、卵，无碎渣而新干者。二等:黄白色，光亮，片大整齐，不带皮、卵，有碎块但不超过20%之新干者。三等:黄色或黄褐色，乌暗无光，碎块较多，无皮、卵，不变质而干燥者。混等：干货，呈不规则的脑髓似的块状，黄白色光亮，间有黑红色。片大，味腥[6～9]。

近些年来，随着社会的发展，人民生活水平的提高，东北林蛙油逐步进入了公众的日常生活。在东北各地，尤其是在黑龙江，许多林蛙养殖场已经建立，相应的林蛙制品厂也已经形成规模，产品远销海外[10～15]。但是从总体而言，我国的林蛙产业还处于低端。林蛙制品也多由传统工艺制备而成[16～18]。相应的林蛙保健食品产业发展速度虽然很快，但并未形成规模。

1 材料与方法

1.1 实验材料

林蛙为3月份采集，3月龄，购于伊春市五马河区林蛙养殖场。

昆明种小鼠，雄性，5周龄，体重200g～229g，自由摄食、饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 林蛙油的提取

1.取材。从东北林蛙上取下东北林蛙的输卵管，使用生理盐水清洗。2.匀浆。使用组织匀浆机，将取下的输卵管匀浆。3.盐析。在洗脱液中加入固体硫酸铵,至比重达到1.24,置4℃冰箱过夜。取出后过滤,收集滤液。4.萃取。向滤液中加入乙酸乙酯，充分混合，静置2～3h。5.收集。使用旋转蒸发仪，收集所提取的油相有机物，后将油相有机物融于10%的乙醇液中。

1.2.2 衰老模型的制备

小鼠每日颈背部皮下注射5%D-半乳糖生理盐水溶液0.5mL/只，连续6周。给药器械需经高压蒸汽灭菌，每只鼠注射前需用75%酒精搽拭注射针头。普通饲料常规饲养。

1.2.3 实验小鼠的分配

实验小鼠共分为3组，共45只，各15只。一组为对照组，使用传统方法提取的东北林蛙油灌胃，每日一次；另一组为实验组，使用改良方法提取的东北林蛙油，灌胃，每日一次；第三组为空白对照组，使用的小鼠为D-半乳糖所致衰老小鼠。

1.2.4 检测实验

1.2.4.1 负重游泳时间的测定

于末次给药后24h，在小鼠尾根部系一重为2g的砝码，将小鼠轻轻放于游泳池水面上(游泳池为一内壁光滑的圆形塑料桶，桶内水深20cm，水温恒定于18℃，水面距桶口10cm)，用秒表记录小鼠自放在水面至沉入水底且不再挣扎的时间，此时间即为负重游泳时间。

1.2.4.2 耐常压缺氧时间的测定

于末次给药后30min将小鼠单只放入装有10g钠石灰的150mL无色透明的广口瓶内，用周围涂了凡士林的瓶盖迅速密封广口瓶，用秒表记录自瓶口密封至小鼠呼吸停止的时间，此时间即为耐常压缺氧时间。

1.2.4.3 碳粒廓清实验

制备墨汁稀释液:将墨汁摇匀后用NS稀释(NS与墨汁的体积比为5:1)，将稀释液置于超声波清洗器内超声混匀2min。

末次给药后30min，小鼠尾静脉注射墨汁稀释液10mL/kg体重，于注射后1min（t1）及5min(t2)而从眼眶静脉丛各取血40mL，溶于4mL l%(w)Na2C03溶液中，在光径1cm、波长680nm处以Na2C03溶液空白管调零测定吸光度A1及AZ，并取小鼠肝、脾称其湿重。

1.2.4.4 学习及记忆能力的测定

分别于皮下注射5%D-半乳糖生理盐水溶液前、注射3周及6周时测定学习及记忆能力。

跳台法：给药后30min，将小鼠放在跳台箱内未通电的箱底铜栅上适应3min，然后对箱底的铜栅通电5min。小鼠受到电击，其正常反应是跳上陶瓷圆柱体平台以躲避伤害性刺激。若小鼠跳回到箱底铜栅上，即为错误。以5min内的错误次数作为学习成绩。24h后重做该实验，将通电时间改为3min，以小鼠第一次由陶瓷圆柱体平台跳回到箱底铜栅上所需的时间 (即潜伏期)及3min内的错误次数作为记忆成绩。

2 结果与分析

2.1 验证实验结果

2.2.1 对常压耐氧时间级附中游泳时间的影响

由表1可见，相对于空白对照组，传统对照组和实验组在常压耐氧时间和负重游泳时间上都有很大的提高。但相对传统对照组，实验组在此两项数据上的提高程度更大些。

表1 Table 1

2.2.2 对碳粒廓清能力的影响

如表2所示，使用改进方法和传统工艺制备的东北林蛙油均能使D-半乳糖所致衰老模型小鼠己降低的碳粒廓清能力显著升高。但两种之间的差异并不显著。

表2 Table 2

2.2.3 跳台法

如表3所示：在6周后，两种林蛙油制品均可提高小鼠的学习能力。但相对而言，采用新工艺提取的林蛙油的效果更好些。

表3 Table 3

3 结论

本实验通过采用部分动物实验，验证东北林蛙提取脂肪酸的抗衰老作用。通过本实验，可以明知东北林蛙提取物在某些方面的保健作用强于采用传统工艺制备的东北林蛙油。但本实验所取得的数据，与吴庆平,吴英俊等所得实验结果存在一定差距。可能是因为实验所取原料的差异所致。

在进行本项实验之前，笔者根据文献调查发现：大多数林蛙加工者仍采用所谓的传统工艺制备林蛙油。可见本实验提出新方法有很大的应用空间。但新方法耗费大，仍有许多需要改进的地方才能适用于工业生产。

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