气腹预处理在家兔气腹模型中减轻肺损伤作用的研究*

包延丽 宁加娟 李雪梅

CO2注入腹腔使腹内压增高可引起腹腔内血管血流阻力增高、灌注不足，从而导致内脏缺血，而放气降低了腹压，增加了脏器的灌注，因而在腹腔镜手术过程中出现了类似缺血/再灌注现象[1]。研究表明，气腹预处理有类似缺血预处理的作用，可以减轻腹腔镜气腹造成的腹内脏器氧化损伤[2]，但预气腹是否有减轻肺组织损伤的作用尚少见报道。本实验以家兔为实验对象对此方面进行了初步研究和探讨，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 普通级健康新西兰大耳白兔40只购自广西医科大学动物实验中心，月龄3～5个月，雌雄不拘，质量2.8～3.2 kg。髓过氧化物酶（MPO）活性试剂盒购自南京建成生物工程研究所，丙泊酚注射液（力蒙欣，20 mL：200 mg，西安力邦制药），OLYMPUS UHI-2全自动气腹机（日本）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 按随机数字法将40只家兔分为4组，即对照组（N组，假气腹组）、短时间气腹组（S组，气腹时间持续1 h）、长时间气腹组（L组，气腹时间持续3 h）、气腹预处理组（P组，气腹5 min后解除气腹5 min，再次建立气腹并持续3 h），每组10只。剔除标准：实验中由于建立气腹模型而致皮下气肿者、各种原因导致围术期心跳骤停和自主呼吸停止者。实际纳入研究的家兔为N组10只、L组9只、S组9只、P组8只。

1.2.2 麻醉及气腹模型的建立 全组麻醉前禁食6 h，耳缘静脉滴注生理盐水（4 mL·kg-1·h-1）以补充非显性失水，静脉注射丙泊酚5～7 mg/kg麻醉诱导（注射时间大于2 min），待家兔四肢及尾部放松、睫毛反射消失后将动物固定于动物手术台上，给于0.5 L/min的鼻导管供氧，麻醉维持丙泊酚20～30 mg·kg-1·h-1，持续微量泵泵入。切开颈部正中皮肤，钝性分离各层组织，行左颈总动脉穿刺置管，连接压力换能器进行动脉有创血压监测，术中根据家兔肢体动作及血压、心率情况，酌情追加丙泊酚，力求心率、血压等各项指标接近生理值状态，以排除血流动力学不稳定对实验结果的干扰。使用20号硬膜外穿刺针替代气腹针建立气腹模型，除对照组不做气腹外，其余各组CO2腹内压力恒定于8 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。

1.2.3 观察指标和样品采集 （1）血浆蛋白样本采集：各组均于气腹建立前采集动脉血，用于测定血浆总蛋白含量。（2）支气管肺泡灌洗液（BALF）采集及处理:解除气腹后20 min，迅速剪开胸骨柄暴露肺组织并切断气管，止血钳夹闭右主支气管后，用4℃生理盐水分3次行支气管肺泡灌洗，灌洗液量分别为5、2、2 mL，每次灌洗均反复抽吸3次，将所得肺泡灌洗液用2层消毒纱布过滤，置入离心管中离心（4℃，3 000 r/min，15 min），取上清液检测BALF蛋白含量，取下层沉淀液检测白细胞（WBC）计数。（3）肺组织湿（W）、干（D）质量测定：结扎右肺中间叶并将其切除，取其核心部位一小块组织，用滤纸吸干肺组织表面血污后放入称过质量的玻璃试管中，称湿质量后置入60℃电热恒温干燥箱中，7 d后测干质量。（4）肺组织MPO活性测定：取肺组织小块于-80℃深低温冰箱冷冻保存，用化学比色法测定肺组织MPO活性。（5）肺组织病理切片制作：取右肺组织约20 g，10%福尔马林固定、石蜡包埋、切片。

1.2.4 观察指标计算公式 肺通透指数（LPI）=BALF总蛋白/血浆总蛋白；MPO活力单位（×10-3U/mg）=（A3-A1）/1 000×肺质量（mg，A3-A1为第3 min和第1 min吸光度之差）；肺组织含水量（%）=（肺湿质量-肺干质量）/肺湿质量×100%

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5软件包进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）或M（P25，P75）表示，组间各均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺组织损伤指标比较 （1）肺组织含水量：N、S、P 3组间差异无统计学意义（P＞0.05），N、P及S组均低于L组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（2）LPI：N、S、P 3组间差异无统计学意义（P＞0.05），但均小于L组，差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）BALF中WBC计数：L组明显高于其他3组（P＜0.01），P组明显高于N组（P＜0.01），S组与N组差异无统计学意义（P＞0.05）。（4）肺组织MPO活力：L组明显大于其他3组（P＜0.01），P组大于N组（P＜0.05），N组与S组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组肺组织损伤观察指标及比较结果

2.2 各组肺组织病理改变 N组：肺泡壁结构完整，间质无水肿，肺泡腔内未见明显蛋白液渗出及中性粒细胞聚集，肺组织血管及部分支气管周未见明显的炎性细胞浸润，见图1。S组：肺泡壁结构尚完整，局灶肺间质水肿，肺泡间隔稍增厚，肺组织小血管周及部分支气管周见少许炎性细胞浸润，见图2。P组：肺泡壁结构尚完整，局灶肺间质水肿，肺泡壁间隔增厚，肺组织小血管周及部分支气管周见少许炎性细胞浸润，见图3。L组：局部肺泡壁断裂，肺间质水肿，肺泡间隔增厚，肺组织弥漫性充血出血，肺泡腔内红细胞及中性粒细胞聚集，肺组织小血管周及部分支气管周见较多炎性细胞浸润，肺泡腔内少许蛋白液渗出，见图4。

3 讨论

气腹导致的缺血/再灌注现象被认为是造成肝肾组织损害、超微结构改变的主要原因[3]。气腹后大鼠的肝、肺等组织发生脂质过氧化和氧自由基增加[4]。国外有学者对预施腹腔镜手术动物先进行5～10 min的气腹预处理，结果表明气腹预处理（预气腹）有类似缺血预处理的作用，能更有效减轻气腹所致的肝肾小肠等脏器的氧化损伤[5-6]。本实验将LPI及肺组织含水量等指标作为观察气腹及气腹预处理时家兔肺损伤情况的判断指标，因急性肺损伤时肺泡上皮和血管内皮细胞受损，通透性增高，使血浆及蛋白成分外渗，引起肺间质和肺泡水肿，严重者可致小血管破裂，肺泡腔出血，所以LPI及肺组织含水量等指标在某种程度上可反映肺组织损伤程度。本研究中L组肺组织含水量和LPI大于其他各组，P组与对照组、S组的差异无统计学意义，提示气腹时间超过3 h可以导致肺损伤，而气腹预处理在一定程度上减轻了肺损伤。另一肺损伤指标为肺MPO活力，MPO是中性粒细胞（polymorphonuclear leuko⁃cyte，PMN）嗜天青颗粒释放的过氧化物酶类，其活性与PMN数量呈正比，是PMN标志酶，其有弱的过氧化氢酶活性，参与中性粒细胞氧代谢，最终产物次氯酸、活性氧分子等可加重肺损伤，肺MPO活力常用来表示中性粒细胞肺内滞留指数，其变化可敏感反映组织早期损伤。本研究显示，在长达3 h的CO2气腹后肺MPO活力明显高于1 h气腹组和对照组，BALF中WBC计数明显增多，说明PMN在肺内大量聚集可能是造成L组肺损伤的原因之一，P组肺组织MPO活力明显小于L组，且BALF中WBC较L组减少，提示P组预气腹所引发的类似缺血预处理现象，在一定程度上减轻了长时间气腹所导致的肺损伤，该作用可能是通过抑制PMN在肺内的聚集达到的。

图1 N组肺组织光镜观察（HE×200）

图2 S组肺组织光镜观察（HE×200）

图3 P组肺组织光镜观察（HE×200）

图4 L组肺组织光镜观察（HE×200）

肺组织病理切片可见，L组有炎细胞浸润以及肺泡壁变薄、断裂，肺泡腔扩张、融合加剧。而炎细胞的浸润与细胞损伤有关。这种损伤的机制包括肺组织细胞缺血缺氧、组织缺血再灌注以及中性粒细胞的呼吸爆发所伴随的腺苷三磷酸的大量消耗等，这些影响最终导致了肺组织在CO2气腹后发生损伤。

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