同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞IκB和NF-κB表达的影响*

徐 倩 周晓慧 曹 凯 牛成伟 张金环 胡欣欣

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是非蛋白构成型含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中的一个重要中间产物。研究表明Hcy可以促进动脉粥样硬化及血栓的形成[1]。本研究通过观察在Hcy刺激下人脐静脉内皮细胞（human umbilical veins en⁃dothelial cells，HUVECs）的核因子（NF）-κB、NF-κB抑制蛋白-α（IκB-α）的表达情况，探讨Hcy致动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的机制，为临床预防治疗AS提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Hcy、四甲基噻唑氮蓝（MTT）均购自Sigma公司，DMEM培养基购自Gibco公司，碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）购自pepro Tech公司。Trizol购自invitrogen公司。鼠抗人NF-κB p65抗体、β-actin抗体购自Santa Cruz公司。兔抗人IκB-α一抗，二抗（山羊抗兔IgG/辣根酶标记）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0购自宝生物工程（大连）有限公司。 HERAcell 150型CO2孵育箱（Heraeus公司）、LEICA DMIL 090-135.001型倒置显微镜（Wetzlar GmbH公司）、净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）、Multiskan Mk3酶联仪（芬兰）、DYY-7型转移电泳仪（北京市六一仪器厂）、PTC-100（MJ RESEARCH, INC）、紫外可见分光光度计（DU800）购自BECKMAN COUL⁃TER公司。

1.2 HUVECs培养及分组 取健康剖宫产新生胎儿脐带，PBS液冲洗干净，用1∶1的0.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%的胰酶-0.02% EDTA（V∶V=1∶1）消化13 min，收集消化液，1 000 r/min离心10 min后，弃上清，用含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培养基重悬，接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后换液，待细胞达到80%融合时，用0.125%胰酶-0.01%EDTA（V∶V=1∶1）传代培养，实验用第2、3代细胞，分组如下：正常对照组细胞加含20%胎牛血清和10 μg/L bFGF的DMEM培养基；Hcy剂量组细胞在加入上述培养基基础上再分为4组，分别加入2.5 mmol/L Hcy（H1）、5 mmol/L Hcy（H2）、10 mmol/L Hcy（H3）及15 mmol/L Hcy（H4）。

1.3 MTT法检测细胞活性 将第2代HUVECs细胞以1.0× 108/L密度种于96孔板中，在37℃，5%CO2培养箱内培养至细胞达到80%融合时，按上述实验分组处理，培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL。振荡溶解后，用酶标仪测定在波长490 nm处各孔的光密度（OD）值。

1.4 RT-PCR检测不同浓度Hcy对HUVECs中NF-κB p65 mRNA表达的影响 将第2代HUVECs细胞接种于24孔培养板中，每孔加入Trizol 300 μL，提取各组细胞总RNA。按Ta⁃KaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0试剂盒说明进行逆转录反应。NF-κB p65引物上游为5-GCACTTACGGATTCTGGT GG-3，下游为5-CTCAAACGCTGGTGTTAGGC-3；扩增片段426 bp。β-actin引物上游5-AGCGGGAAATCGTGCGT GAC-3，下游为5-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，扩增片段为453 bp。PCR反应体系为20 μL。NF-κB p65 PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增30个循环。最后10℃延伸10 min。β-actin的退火温度为58℃。取5 μL PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察并摄取图象。NF-κB p65 mRNA相对表达强度=NF-κB p65 mRNA扫描值/β-actin扫描值。

1.5 Western blot检测不同浓度Hcy对HUVECs中IκB-α蛋白表达的影响 将第2代HUVECs细胞接种于25 cm2培养瓶中，提取细胞总蛋白，用二喹林甲酸（BCA）法测定总蛋白浓度。取30 μL蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳，电转移2 h至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）的膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后与1∶200稀释的兔抗人IκB-α一抗4℃孵育过夜，与1∶5 000稀释的二抗室温孵育1 h，再与化学发光试剂（ECL）室温作用3 min，后曝光、显影和定影。胶片扫描后，采用Quantity One软件对显影条带进行分析，计算IκB-α条带与β-actin条带的灰度比值，作为IκB-α蛋白的相对表达水平。

1.6 免疫组化检测各组HUVECs中NF-κB p65核转移的变化 第3代细胞接种于有盖玻片的小培养皿中。方法:（1）丙酮固定10 min。（2）3%H2O2封闭10 min。（3）滴加A液，37℃孵育30 min。（4）加鼠抗人NF-κB p65一抗（1∶50）于4℃过夜。（5）滴加B液，37℃孵育30 min。（6）滴加C液，37℃孵育30 min。（7）显色，复染。以上每步之间用PBS洗3次，每次5 min。（8）脱水，封片。（9）在Mivnt显微图像分析系统下进行半定量分析。显棕黄色颗粒为阳性。对采集的图片中棕黄色阳性颗粒进行密度扫描，测平均灰度值，观察NF-κB p65核转移变化.

1.7 统计学处理 运用SPSS 11.5进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度Hcy对HUVECs细胞生长及NF-κB p65 mRNA表达的影响 H1组较对照组对正常细胞生长的抑制作用不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），其他各组与对照组间OD值差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；Hcy抑制HUVECs的生长随着浓度的升高有增强趋势。H1、H2、H3及H4组较对照组NF-κB p65 mRNA的表达均明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着浓度升高，Hcy对HUVECs细胞NF-κB p65 mRNA表达的影响呈递增的剂量依赖趋势，见图1、表1。

表1 不同浓度Hcy对HUVECs细胞活力及NF-kBP65 mRNA表达的的影响 （±s）

表1 不同浓度Hcy对HUVECs细胞活力及NF-kBP65 mRNA表达的的影响 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 n OD值 统计学处理P对照组（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.546 7±0.049 3 0.525 0±0.032 1 0.498 3±0.033 1 0.373 3±0.045 9 0.295 0±0.032 1 46.015组比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）0.348 0.043＜0.001＜0.001组别 n NF-κB p65/β-actin 统计学处理P对照组（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.463 3±0.030 8 0.539 4±0.009 3 0.683 8±0.034 8 0.779 9±0.021 2 0.912 6±0.016 4 165.264＊组比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）0.013＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001＜0.001

2.2 Western blot及免疫组化结果 H1、H2、H3及H4组IκB-α蛋白的表达与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），且随着浓度的升高，IκB-α/ β-actin呈递减趋势。对照组NF-κB p65在细胞中基本无表达，Hcy各处理组HUVECs细胞中可见NF-κB p65阳性产物棕黄色颗粒，H1、H2组阳性表达颗粒较少，主要分布在细胞质中；H3、H4组阳性表达颗粒明显增加，胞质及胞核内均有分布，胞核内明显增加；H4组阳性表达颗粒核内分布尤为明显，见表2、图2。

3 讨论

高Hcy是导致动脉粥样硬化的一种独立危险因素，流行病学的研究报道显示，大约有40%的冠心病和脑血管动脉粥样硬化的患者存在高Hcy血症[2]。目前研究认为内皮损伤是导致AS的始动因素之一[3]，并提出AS是一系列复杂的慢性炎症反应的过程[4]，在这一过程中NF-κB发挥重要的调控作用。

NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的基因多显性转录核因子，控制着细胞因子、黏附因子等基因的表达。NF-κB的2个亚基p50、p65属于DNA结合蛋白Rel家族[5]。一般情况下，NF-κB与抑制蛋白IκB结合，使NF-κB滞留在胞质中呈非活性状态[6]。受到刺激后，IκB激酶被激活，使IκB蛋白降解，NF-κB从多聚体上释放出来，进入细胞核，与DNA结合，调控细胞因子、黏附分子及生长因子的基因表达[7]，因而使这些基因控制的细胞因子、黏附分子等增多。大量的单核细胞趋化蛋白、细胞间黏附分子促进单核细胞与内皮细胞黏附并向内皮下迁移及泡沫化，从而形成脂质条纹、纤维斑块、粥样斑块，进而导致AS的形成[8]。

表2 不同浓度Hcy对HUVECs细胞IκB-α蛋白表达及NF-κB p65核转移的影响 （±s）

表2 不同浓度Hcy对HUVECs细胞IκB-α蛋白表达及NF-κB p65核转移的影响 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 n IκB-α/β-actin 统计学处理P对照组（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 1.109 5±0.0120 1 1.036 9±0.0298 9 0.918 1±0.0440 1 0.597 1±0.0224 4 0.329 7±0.0243 0 394.652＊组比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）0.011＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001组别 n NF-κB p65统计学处理P对照组（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.022 6±0.003 3 0.103 6±0.017 6 0.227 8±0.020 1 0.599 7±0.039 1 0.822 2±0.024 9 1 223.400＊组比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

本实验结果显示，随着Hcy浓度的升高，细胞活力逐渐下降，细胞形态变化越来越差，表明Hcy对内皮细胞有明显的损伤作用，浓度越高损伤越严重；Hcy可使NF-κB p65 mRNA表达显著增强，表明Hcy可促进NF-κB p65的转录；且随着Hcy浓度的升高，IκB的含量下降，并呈剂量依赖趋势。随着Hcy浓度的升高，NF-κB p65激活后进入细胞核，NF-κB p65在细胞核中的含量明显增多，表明Hcy对NF-κB具有激活作用。

综上所述，Hcy不仅促进NF-κB转录水平的表达，而且可促使IκB的降解，使NF-κB p65被释放、激活，进而转移至细胞核内，提示进入细胞核内的NF-κB p65在转录水平将可能促进其下游的趋化蛋白因子、细胞间黏附分子等基因表达，使单核细胞与内皮细胞黏附，进一步损伤血管内皮，促进动脉粥样硬化的形成和发展。由于NF-κB在诱导炎症反应，促进AS形成的病理过程中起重要作用，因此可以通过抑制过度活化的NF-κB，下调其调控促炎因子的表达，抑制多种黏附分子及细胞因子，从而有效地抑制炎症反应，延缓和逆转AS的发生和发展，为其预防和治疗提供新的策略。

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