生物保鲜剂在年糕生产中的应用研究

严 偲，刘青梅，杨性民

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201300；2.浙江万里学院宁波市农产品加工技术重点实验室，浙江 宁波 315100）

宁波水磨年糕属地方著名传统特产，是以粳米为原料，经浸泡、水磨、压榨、蒸粉、挤压成型、冷却等多道工序加工而成的一种传统食品，口感爽滑、韧性可口，深受消费者喜爱[1-2]。但由于年糕主要成分为淀粉，含水量和水分活度较高，很容易受到细菌和霉菌污染引起酸败发霉，保质期短。本试验就年糕保鲜这一主题，运用 ε-聚赖氨酸[3]、溶菌酶[4]、乳酸链球菌素[5]、纳它霉素[6]等高效生物防腐保鲜剂，以壳聚糖[7-8]为载体，对年糕进行涂膜保鲜。采用响应面法（RSM），建立回归方程模型，找出最优组合，配制复合保鲜剂，降低年糕中腐败微生物的含量，从而达到保鲜的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料与试剂 年糕：宁波慈城冯恒大年糕厂；菌落计数、孟加拉红培养基：杭州微生物试剂有限公司；ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、纳它霉素：中国银象生物工程有限公司；溶菌酶：Sigma公司；甘氨酸：国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖：宁波市镇海海鑫生物制品有限公司。

1.1.2 仪器与设备 手提式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械有限公司；BLON-8型无菌均质器：上海比朗仪器有限公司；DZ-400真空包装机：上海青葩食品包装机械有限公司；SPX型智能生化培养箱：宁波江南仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验 以1%壳聚糖为载体，试验分别采用 ε-聚赖氨酸（ε-PL）+0.01%醋酸[9]、溶菌酶+6%甘氨酸[4]、乳酸链球菌素（Nisin）、纳它霉素溶液浸涂年糕，研究ε-PL、溶菌酶、Nisin对年糕中细菌的抑制作用效果以及纳它霉素对年糕中霉菌和酵母的抑制作用效果。

1.2.2 复合因子响应面试验 在单因素试验结果的基础上，应用RSM原理，采用中心组合设计（CCD）,选取 ε-PL、溶菌酶、Nisin 三个因素为自变量，分别用A、B、C表示，每个因素取5个水平，以抑菌率为响应值设计。试验因素水平编码见表1。采用Design Expert 7.0软件对试验结果进行统计分析。

表1 因素水平编码 （%）

1.2.3 微生物检测方法 菌落总数的测定：参照国标GB/T 4789.2-2010；霉菌和酵母计数：参照国标GB/T 4789.15-2010；抑菌率=（lg对照样品菌落总数－lg保鲜样品菌落总数）/lg对照样品菌落总数×100%

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 ε-PL对年糕中细菌的抑制作用 由图1可以看出，ε-PL对年糕中的细菌抑制效果明显，随着ε-PL浓度的增加，菌落总数明显减少，二者呈正相关关系；当ε-PL浓度大于0.2%时，ε-PL对年糕中细菌的抑制作用不再明显。

图1 不同浓度ε-聚赖氨酸对年糕中细菌的抑制效果

2.1.2 溶菌酶对年糕中细菌的抑制作用 由图2可以看出，溶菌酶对年糕中的细菌有着较好的抑制效果，当溶菌酶浓度达到0.05%时，抑制效果最好；浓度继续增加，抑制效果反而不好，这与文 献[4]报道中溶菌酶使用的最适浓度为0.05%保持一致，说明其在年糕等糕团食品中亦可使用。

图2 不同浓度溶菌酶对年糕中细菌的抑制效果

2.1.3 乳酸链球菌素（Nisin）对年糕中细菌的抑制作用 由图3可以看出，添加Nisin可以明显抑制年糕中的细菌，当Nisin浓度达到0.02%时，抑制效果最显著，这一结果与刘青梅等[2]研究结果一致。

图3 不同浓度乳酸链球菌素对年糕中细菌的抑制效果

2.1.4 纳它霉素对年糕中真菌的抑制作用 为了提高对年糕中霉菌的抑制作用，保证保鲜效果，试验在配制复合保鲜液的过程中添加纳它霉素，其对年糕中真菌的抑制作用的试验效果见图4。从图4中可以看出，随着纳它霉素浓度的增加，霉菌和酵母计数结果亦随之下降，当纳它霉素浓度达到0.04%时，从菌落形态观察，基本无霉菌生长，虽未能完全抑制酵母菌的生长，但年糕表面已无霉斑产生，考虑到纳它霉素的添加剂量标准[10]，在本试验中将纳它霉素的添加量确定为0.04%。

图4 不同浓度纳它霉素对年糕中真菌的抑制效果

2.2 复合因子对年糕中细菌的抑制作用

2.2.1 响应面试验设计及结果 试验对年糕中细菌起主要抑制作用的三个因子（ε-PL、溶菌酶、Nisin）进行响应面组优化试验，采用CCD设计，以抑菌率为响应值进行数据统计，设计方案及结果见表2。

表2 CCD设计方案及结果 （%）

2.2.2 回归模型的建立与方差分析 对表2中数据进行二次多元回归拟合，获得抑菌率的预测值对ε-PL、溶菌酶、nisin的二次多元回归方程：

对回归方程进行方差分析和系数显著性检验，结果见表3。

由方差分析可知：（1）此模型的P＜0.000 1，响应面回归模型达到高度显著水平，其中决定系数R2=0.990 4，说明99%的试验数据可以用此方程解释，失拟项在0.01水平上不显著，回归模型的拟合程度较好，可以用此模型进行分析和预测。（2）回归方程分析：一次项 A、B、C 均为 P＜0.000 1，说明 ε-PL、溶菌酶、Nisin这三个因子对抑菌率的影响都极其显著，抑菌效果为ε-PL＞Nisin＞溶菌酶；AC交互项P值为 0.026 7，在0.01＜P≤0.05范围内，说明ε-PL和Nisin之间的交互作用显著；同理，AB、BC对响应值不显著，说明ε-PL和溶菌酶之间的交互作用不显著，溶菌酶和Nisin之间的交互作用不显著。

2.2.3 响应曲面和等高线图解析 将一个因子固定在0水平，分析其余两个因子间的交互作用对响应值的影响，响应曲面和等高线图见图5~7。响应面回归模型高度显著，抑菌效果：ε-PL＞Nisin＞溶菌酶。

表3 响应面二次回归模型方差分析

图5 Y=f（A，B）的响应曲面（C=0.2）

图6 Y=f（A，C）的响应曲面（B=0.05）

由图5可以看出，等高线曲率较小，形状近似椭圆，说明ε-PL与溶菌酶之间存在着交互作用。当ε-PL的含量一定时，随着溶菌酶含量的不断增加，抑菌率先随之增加，后又有所下降。这可能跟溶菌酶的特殊性有关，主要对革兰氏阳性菌有溶菌作用，然而年糕中的腐败菌不只是革兰氏阳性菌，还有其他微生物。若溶菌酶浓度过大，与年糕表面接触的ε-PL浓度就相对下降，抑菌效果反而不好。

图7 Y=f（B，C）的响应曲面（A=0.2）

由图6可以看出，等高线曲率较小，形状近似椭圆，说明ε-PL与Nisin之间存在着交互作用。又由显著性检验结果（P＜0.05）可知，二者之间交互作用影响显著。当ε-PL的含量一定时，Nisin浓度增加，抑菌率随之增加；当Nisin含量增加到一定程度后，Nisin浓度继续增加，抑菌率反而减小。这可能与ε-PL和Nisin的抑菌机理相关，二者均为从微生物发酵产物中提取合成的多肽化合物，ε-PL是通过静电粘附于细胞膜表面，同时作用于蛋白和细胞膜的合成系统，与核糖体结合抑制蛋白和酶的合成，从而达到杀菌的目的[3]；Nisin是通过一个特别的对接分子附着在原生质膜上，创造了一个由几个Nisin分子组成的孔形成单位，这种相互作用导致细胞膜上形成暂时的气孔，消除细胞的离子梯度，使细胞裂解死亡[11]。因此，一定浓度的ε-PL和Nisin复配，随着Nisin浓度增加，可起到协同增效的作用，这与李诚等[3]研究结果是一致的。但当Nisin浓度过高时，与年糕表面接触的ε-PL浓度就相对下降，抑菌效果也就随之降低了。

由图7可以看出，等高线形状近似圆形，说明溶菌酶和nisin之间的交互作用不显著。

2.3 复合保鲜剂最佳组合的确定

由软件分析得出复合保鲜剂的的最佳组合：ε-PL为0.3%、溶菌酶为0.06%、Nisin为0.02%，理论最佳抑菌率为0.76。结合生产实际，考虑到溶菌酶成本等，将复合保鲜剂主要成分修正成ε-PL为0.3%、溶菌酶为0.05%、Nisin为0.02%，预测抑菌率为0.73。

采用修正后的复合保鲜剂组合做年糕保鲜的验证试验，重复3次，实测抑菌率为0.69，与理论预测值的相对误差5%。

3 结论

（1）单因素试验结果表明：ε-聚赖氨酸对年糕中细菌的抑制作用效果最为显著，纳它霉素对年糕中霉菌有较好的抑制作用。

（2）多因素试验结果表明：三种保鲜剂对年糕的防腐保鲜效果为ε-PL＞Nisin＞溶菌酶。二次回归模型分析（R2=0.990 4），表明模型拟合程度好。

（3）响应曲面分析：ε-聚赖氨酸和Nisin之间等高线形状近似椭圆，显著性检验结果（P＜0.05），可见ε-聚赖氨酸和Nisin之间交互作用影响显著，二者复配可起到协同增效的作用。ε-PL与溶菌酶之间等高线形状近似椭圆，说明ε-PL与溶菌酶之间存在交互作用。溶菌酶和Nisin之间等高线形状近似圆形，说明溶菌酶和Nisin之间的交互作用不显著。

（4）综合考虑，年糕复合保鲜剂成分为：壳聚糖1%、ε-聚赖氨酸0.3%、醋酸0.1%、溶菌酶0.05%、甘氨酸6%、乳酸链球菌素（Nisin）0.02%、纳它霉素0.04%。该复合年糕保鲜剂预测抑菌率为0.73。实测抑菌率为0.69，与理论值相对误差5%。

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