峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460增殖的抑制作用观察

马超英 涂显琴 牛顺子 高雅蓉 唐静 耿耘 蒋合众

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，它严重影响人类生命健康，目前已成为世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一。峨参是伞形科峨参属植物，与峨蕊、雪磨芋历来被人们认为是峨眉山的三大特产而闻名远近。中医认为峨参有健脾益气，活血化瘀的作用。有文献报道从峨参根中提取出一种具有抗肿瘤活性的有效成分，结构研究表明是去氧鬼臼毒素(峨参内酯)，对人体子宫颈腺癌传代细胞系的作用具有生物活性［1］，

而对肺癌的作用笔者尚未见文献报道。本文主要研究峨参石油醚提取物对肺癌细A549和H460增殖与凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞株A549和H460购自于四川大学华西国家重点实验室。

1.2 药品与试剂 RPMI-1640和胰蛋白酶均采用Gibco进口分装，MTT购自宝信生物有限公司。峨参饮片购自于四川省峨眉山市仙山中药饮片公司，经本院宋良科副教授鉴定为四川峨眉山产伞形科峨参属植物峨参的干燥块根。其余试剂均采用分析纯。

1.3 主要仪器 CO2恒温孵箱(3110型，美国Thermo公司)、细胞培养板、培养瓶(美国Coster公司)、酶标仪(Elx-800型，美国Bio-Tek公司)、离心机(L420型，长沙湘仪离心机有限公司)、倒置相差显微镜(日本索尼公司)、荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)、超净工作台(BSW-880，江苏苏净集团有限公司)、闪式提取器(JHBE-50型，河南金鼎科技有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 峨参石油醚提取物的制备:将峨参切断，粉碎成细小颗粒，过20目筛，烘干，用8倍量80%乙醇浸泡24 h，利用闪式提取器，分别间断提取共3 min(15 000 r/min，1 800 W)，抽滤，得到滤液，旋转蒸发仪回收溶剂，得到浸膏。再用石油醚萃取，得石油醚提取物，用旋转蒸发仪回收溶剂，得浸膏，使用前用RPMI-1640调整至实验所需浓度，DMSO(浓度＜0.05%)助溶。

1.4.2 细胞株培养:将肺癌细胞A549和H460接种于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基的培养瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养，每2天换液传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.4.3 峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549、H460增殖抑制作用的检测:取对数生长期细胞接种于24孔培养板内，2× 104个·ml-1·孔-1。细胞贴壁后加入不同浓度的峨参石油醚提取物，共设7个药物浓度梯度，分别为1.25、2.5、5、10、20、40和80 μg/ml，每个浓度3个复孔，每孔体积500 μl，培养48 h后，每孔加入1 mg/ml MTT工作液500 μl，37℃放置4 h，弃上清，每孔加入500 μl 0.4%酸化异丙醇，220 r/min摇床震荡5 min溶解结晶，经充分震荡后，吸取200 μl至96孔酶标板于全自动酶标仪检测570 nm波长处的各孔吸光度(OD值)，0.1%DMSO作为阴性对照，根据0.1%DMSO值绘制曲线，比较不同浓度峨参石油醚提取物对2个细胞株增殖的影响［2］。

1.4.4 DAPI染色:将洁净无菌盖玻片置于6孔板内，种入细胞培养过夜，使为60%～80%。设对照组、2.5 μg/ml、5 μg/ml峨参石油醚提取物组(A549)和对照组、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml峨参石油醚提取物组(H460)，分别继续培养24 h，吸弃废液，然后用4%多聚甲醛固定细胞爬片35 min，1×PBS冲洗3次，每次2 min，加入2 μl DAPI染色液，染色15 min，1×PBS冲洗2次，取出爬片用封片液封片，荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，实验组及对照组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460增殖的抑制作用 结果显示，随着药物浓度的升高，细胞存活率不断下降，峨参石油醚提取物对肺癌细胞H460的抑制作用比对细胞A549明显。经计算得出，峨参石油醚部位提取物对肺癌细胞A549和H460的IC50值分别为6.13 μg/ml和0.97 μg/ml，见图1。

2.2 峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460凋亡的影响倒置显微镜观察到，经峨参石油醚提取物处理48 h后，肺癌细胞A549和H460的生长明显受到抑制，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中［3］。荧光显微镜观察到，经峨参石油醚提取物处理24 h后，肺癌细胞A549和H460生长明显受到抑制，荧光增加，有明显的细胞核断裂和皱缩，随剂量增加，细胞凋亡现象越明显，见图2。

图1 不同浓度峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460生长的抑制作用

图2 峨参石油醚提取物处理后细胞形态(×400)

3 讨论

本实验应用MTT比色法检测峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460增殖的抑制作用，经计算得出其IC50值分别为6.13 μg/ml和0.97 μg/ml，且抑制率与浓度呈明显的效应关系，随着药物浓度的增加，细胞存活率不断下降。用倒置显微镜观察到，经峨参石油醚提取物处理肺癌细胞A549和H460后，癌细胞生长明显受到抑制，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中。不同浓度的峨参石油醚提取物作用于A549和H460细胞，24 h后用DAPI染色，荧光下可见细胞核发生明显皱缩和断裂。

综上所述，本实验通过对峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460的影响，为峨参抗肿瘤的研究提供了实验依据，其抗肿瘤机制有待于进一步研究。

1 Yong Y，Shin SY，Y Lee YH，et al.Antitumor activity of deoxypodophyllotoxin isolated from Anthriscus sylvestris:Induction of G2/M cell cycle arrest and caspase-dependent apoptosis.Bioorg Med Chem lett，2009，19: 4367-4371.

2 钟华，尹蓉莉，谢秀琼，等.不同莪术提取物对小鼠皮肤癌的药效研究.时珍国医国药，2010，21:2566-2567.

3 王维民，刘延庆，戴小军.南蛇藤提取物诱导 SGC-7901胃癌细胞凋亡及其机制.中国生物制品学杂志，2010，23:154-156.