金丝桃苷对四氯化碳诱导肝细胞损伤的保护作用

(中国人民解放军第三军医大学西南医院药学部，重庆 400038)

肝脏损伤是指由多种有害因子和物质引起的肝脏病理和生理异常，每年因肝病死亡的人数约为30万人，但目前尚无可有效减轻肝脏损伤和促进肝细胞再生的药物。金丝桃苷(hyperin，HP)广泛存在于藤黄科、杜鹃花科、豆科及卫矛科等多种植物的黄酮醇苷化合物中，已在20多种植物中被发现。药理研究表明，金丝桃苷具有较好的镇痛、免疫调节等作用，以及较强的抗氧化作用，本研究旨在探讨金丝桃苷对四氧化碳(CCl4)诱导化学性肝细胞损伤的保护作用及其机制，现报道如下。

1 仪器与试药

722s型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);450型酶标仪(美国Bio－Rad公司)。金丝桃苷(中国药品生物制品检定所，批号为111521－200303);CCl4购于Sigma公司;天门冬酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20070312，20070402，20071029，20071010);噻唑蓝(Amresco 公司，北京拜尔迪生物公司分装);二甲基亚砜(DMSO，天津化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 诱导肝细胞损伤所需CCl4适宜浓度的确定

取对数生长期L－02人肝细胞，消化后用RPMI－1640培养液调整细胞密度为5×104/mL，肝细胞活力大于90%。加入96孔培养板中，每孔100 μL细胞悬液，于37℃及5%CO2培养箱中培养24 h，肝细胞全部贴壁生长后待用。以CCl4原液4.82 mL溶于DMSO 5.18 mL，制成5 mol/L的CCl4液，以含 10%胎牛血清的 RPMI－1640 液稀释配成含 2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，30.0 mmol/L CCl4的溶液。加入96孔培养板，以无CCl4的RPMI－1640培养基为空白对照。每个浓度做5个平行孔，培养24 h后，以四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色(MTT)法测肝细胞存活率。以空白对照为标准，CCl4浓度为2.5 mmol/L时，MTT检测显示肝细胞存活率为90.9%，显微镜下细胞形态改变不明显。随着CCl4浓度的升高，肝细胞存活率逐渐降低，且肝细胞逐渐出现核溶解、细胞膜破损、细胞结构不清。当CCl4浓度达到30.0 mmol/L时，肝细胞存活率仅为11.36%。最理想的CCl4造模浓度为 15.0 mmol/L，可较好地显示CCl4肝细胞损伤与保护因子作用的差异。结果见表1。

表1 不同浓度CCl4损伤后肝细胞MTT检测结果(n=5)

2.2 金丝桃苷对CCl4诱导肝细胞损伤的保护作用

调整细胞密度为5×105/mL，将肝细胞悬液加入96孔和24孔培养板中，于37℃及5%CO2培养箱中培养24 h后，肝细胞全部贴壁生长后供试验用。设CCl4模型组(终浓度为15 mmol/L)、金丝桃苷(5，10，20，40，80，160 μg/mL)+CCl46 个处理组、空白对照组、维生素E(终浓度为50 μmol/L)+CCl4组，每组设3个复孔。分别加入CCl4、不同质量浓度的金丝桃苷、维生素E及培养液，继续培养24 h后，收集24孔板中细胞培养液及细胞待测，同时用MTT法测定96孔板肝细胞的存活率。取肝细胞培养上清液，按试剂盒说明书，采用赖氏法测定ALT及AST。弃肝细胞培养液，加0.5 mL 1%Triton－100裂解细胞，充分吹打混匀后收集，2 500 r/min离心10 min，取上清，按试剂盒说明测定谷胱甘肽(GSH)、MDA含量测定。结果见表2及表3。CCl4诱导损伤肝细胞后，促进胞内酶的释放，CCl4模型组培养上清液中的ALT及AST水平较正常明显升高，肝细胞内MDA含量升高，GSH水平及肝细胞存活率明显下降。随着培养液中金丝桃苷质量浓度递增，其肝细胞保护效应逐渐明显，并呈明显的剂量效应关系。80 μg/mL的金丝桃苷已能显著抑制CCl4诱导损伤肝细胞后ALT及AST水平的上升，降低损伤肝细胞中MDA含量，显著升高肝细胞内GSH水平及肝细胞存活率，且效应强度与维生素E对照组相当。

3 讨论

3.1 CCl4诱导肝脏氧化性损伤实验模型的选择

金丝桃苷具有一定的抗氧化活性，为确定该活性是否有助于金丝桃苷在氧化性肝损伤中发挥保护作用。在大量查阅文献的基础上，决定选用CCl4作为肝脏致毒因素[1－2]。CCl4是经典的氧化性肝损伤致毒剂，其致毒机制:一是激活肝微粒体内依赖于CYP450的混合功能氧化酶，产生三氯甲基(－CCl3)、二氯甲基(－CCl2)和过氧化甲基(－CCl3OO)等自由基，致细胞DNA键断裂，并引发膜脂质过氧化链式反应，导致MDA形成增多，肝细胞膜通透性增加，使位于细胞浆中及线粒体中的ALT与 AST释放;二是可促进GSH等抗氧化物的消耗，导致氧自由基损伤进一步加重，最终使肝细胞死亡[3－4]。因此，采用CCl4制备体外肝细胞和大鼠肝损伤模型，可以较明确地反映金丝桃苷的抗氧化活性。

表2 金丝桃苷对CCl4损伤肝细胞培养上清液ALT及AST测定结果(U/L)

表3 金丝桃苷对CCl4损伤肝细胞MDA及细胞存活率的影响

3.2 金丝桃苷对CCl4诱导L－02人肝细胞损伤的保护作用

离体细胞试验的影响因素相对较少，可控性强，能准确反映处理因素对CCl4诱导肝损伤的效应。试验中对CCl4的致肝损伤剂量进行了摸索。目前文献报道的肝细胞损伤的CCl4适宜终浓度在5～20 mmol/L不等[5－7]，而找到适宜的造模浓度(既可有效诱导肝细胞损伤，又可较好反映保护剂的肝保护作用至关重要)。考察了CCl46 个浓度(2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，30.0 mmol/L)的肝细胞损伤效应，结果CCl4浓度不高于10 mmol/L时，肝细胞损伤不明显，细胞存活率大于60%，可能会夸大保护剂的保护作用;CCl4浓度不低于20 mmol/L时，肝细胞损伤变形严重，细胞存活率低于20%，无法准确反映保护作用。因此，最终确定15 mmol/L为最佳造模浓度。

采用体外培养人肝细胞株L－02的试验结果显示，金丝桃苷质量浓度在20 μg/mL到160 μg/mL范围内对CCl4诱导肝细胞损伤的保护作用呈明显的剂量效应关系，剂量为80 μg/mL时肝细胞保护作用已极显著(P＜0.01)，细胞内MDA含量及其释放AST和ALT明显减少，胞内GSH含量和细胞活性则明显提高，效应强度与维生素E对照组相当，表明金丝桃苷对CCl4所致肝细胞损伤具有显著的保护作用。细胞中MDA的含量可反映脂质过氧化的程度，间接反映肝细胞的损伤程度，而GSH是机体清除－CCl3的关键物质，因此推测其保护机制可能与金丝桃苷的抗氧化作用密切相关。为获得抗氧化的直接证据，课题组对金丝桃苷是否通过清除氧自由基、抑制脂质过氧化和减少脂质过氧化产物生成，从而达到保护肝细胞膜和线粒体膜的完整性的研究尚在进行中。

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