大花萱草“东方不败”的组织培养技术研究

杨丽莉，张 晓，张彦琴

（山西省农业科学院旱地农业研究中心，山西 太原 030006）

萱草（Hemerocallis hybrida）是百合科（Liliaceae）萱草属（Hemerocallis）多年生宿根草本植物，主产于我国南、北方大部分地区，欧洲南部也有分布。该属植物适应性广，对土壤要求不严，花多为黄色、并可食用，在我国广为人知。大花萱草通常称为多倍体萱草，因其具有既观花又观叶的双重价值而被广泛用于切花、盆栽及园林绿化等，主要用途是观赏。“东方不败”是从欧美引进的多倍体品种，叶型修长似兰草，丛生；株丛高35～45 cm。花葶粗壮，高50 cm，花朵硕大，直径可达10 cm。花瓣外卷呈粉红色，花心带有金黄晕，色泽娇艳，每葶可着花20余朵。花期6月中旬至9月中旬。其特点是:抗倒伏，复色花艳丽，花多且大，可反复开花，除了作绿化种植外，还可作切花。“东方不败”萱草整株姿态优雅，妩媚动人，甚是惹人喜爱，是大花萱草中重要的新品种。

自然界中，大花萱草一般以分蘖的方式进行繁殖，每年分蘖3～4株，繁殖速度慢，远不能满足商品化生产的需要。植物组织培养技术是指对引进和培育的新品种在短期内进行种苗的大量繁殖、用于生产建设的重要技术方法。科技工作者对大花萱草的组织培养研究已有部分报道[1-6]，但是不同大花萱草品种、不同外植体的培养方法和培养基配方存在较大差异，对“东方不败”萱草的研究尚未见报道。

本试验对大花萱草“东方不败”组织培养技术中的关键技术参数进行了研究，旨在为实现组织培养工厂化育苗提供配套的技术服务。

1 材料和方法

1.1 材料

“东方不败”是由北京紫鹿.艾维生种植园首次从国外引进的大花萱草品种，我们对其进行了引种和驯化栽培。供试材料来源于山西省农科院旱地农业研究中心大花萱草试验田种植3 a的种苗，盛花期取花蕾作材料，以子房为外植体。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织诱导分化培养 采摘苗圃健壮母株上发育正常的花蕾，用洗涤剂清洗表面后，用流水冲洗干净。75%酒精消毒1 min，0.1%HgCl2灭菌15～20 min，无菌水冲洗4次。在无菌条件下剥离子房，横切成片状接种于愈伤组织诱导培养基（表 1）中，暗培养 35 d，温度（25±1）℃，后进行光照培养26 d，光照强度2000～3000 lx。统计愈伤组织诱导分化率。

表1 愈伤组织诱导培养基设置 mg/L

1.2.2 不定芽的增殖培养 愈伤组织分化的不定芽接种于不同增殖培养基（表2）上，每瓶7芽，每种培养基10瓶。光照培养26 d后，统计苗数，计算繁殖系数。光照强度为2000～3000 lx，温度为（25±1）℃。

表2 不定芽继代繁殖培养基设置 mg/L

1.2.3 生根培养 无根小苗接种在不同的生根培养基（表3）上进行光培养，每瓶接7株，每种培养基接种10瓶。第10天起开始观察、记录生根情况。第27天测量根长，统计生根数，计算生根率。光照强度为2000～3000 lx，温度为（25±1）℃。生根率＝生根苗数/接种小苗数×100%。

表3 生根培养基设置 mg/L

1.2.4 驯化栽培 在温室内打开瓶盖炼苗3 d后，取出小苗洗净根部的培养基；再用0.1%多菌灵药水洗根，移植在拱棚内不同基质的苗床上。移栽完毕后浇透水，并用0.1%的百菌清或多菌灵喷雾保苗。前1周遮盖60%的遮阳网，并保持一定的温度、湿度和光照。

2 结果与分析

2.1 子房愈伤组织的诱导分化培养

子房切片接种于10种不同激素配比和浓度配比的诱导分化培养基上，7～10 d子房切片开始膨大，15 d开始出现白色、松散状愈伤组织。随着培养时间的延长，白色、松散状愈伤组织逐渐形成圆球状、致密型、淡黄色胚性愈伤组织块（图 1）。在只有 6-BA 的培养基上（F1，F3，F5，F7，F9，F10），随着 6-BA质量浓度的升高（1～6 mg/L），这种胚性愈伤组织越致密。在6-BA和2，4-D同时存在的 F2，F4，F6，F8号培养基上的胚性愈伤组织比单纯6-BA培养基上的量大，结构紧密，色泽更鲜亮。

将这些愈伤组织转入原号培养基进行继代光照培养，观察发现，愈伤组织的颜色由黄色变成黄绿色，并出现绿色的突起，继而分化出不定芽（图 2）。

从10种培养基愈伤组织分化率的结果（表4）看，F1～F4号培养基在 6-BA1～2 mg/L 的条件下，诱导分化率较低。F5～F8培养基6-BA为3～4 mg/L的范围内，分化率提高，可达30.7%～38.2%。F9～F10号培养基上，随着6-BA质量浓度的继续升高（5～6 mg/L），分化率有所下降。在含有 2，4-D 的培养基上，F2，F4，F6，F8形成的愈伤组织比单纯含 6-BA 的培养基 F1，F3，F5，F7量大，而不定芽的分化率普遍有所下降。因此，子房愈伤组织诱导分化最适宜的培养基为MS＋6-BA4mg/L。

表4 “东方不败”萱草子房愈伤组织的诱导分化率

2.2 芽增殖培养

切下芽块接种在不同的继代繁殖培养基上进行光照培养，7 d左右开始形成丛生芽，25 d长满1瓶（图3）。

从表5可以看出，不定芽在Y1，Y2，Y3和Y4号培养基上的繁殖率高于 Y5，Y6号培养基。Y1，Y2，Y3和 Y4号培养基的 6-BA 质量浓度为 3 mg/L，Y5，Y6号为 2 mg/L，所以，继代繁殖最适宜的6-BA质量浓度为3 mg/L。在添加同等浓度的 IBA和 NAA的培养基 Y3和 Y1，Y4和 Y2上，含IBA的Y3和Y4号培养基的繁殖系数高于含NAA的培养基Y2和Y1，并且IBA较高质量浓度（0.5 mg/L）的Y3培养基比IBA较低浓度（0.3 mg/L）的Y4培养基繁殖系数略高。因此，继代繁殖适宜的培养基为MS＋6-BA 3 mg/L＋IBA 0.5 mg/L，繁殖系数可达6.4。

表5 “东方不败”萱草在不同激素培养基上的繁殖系数

2.3 再生植株的生根培养

将继代培养的小苗转接入生根培养基，观察小苗的生根时间、根的多少和根系的发育状况，第27天测量根长，计算平均根长和平均生根数（图4）。从表6和观察结果可以看出，第9天时，除G1，G2培养基外，其他培养基上试管苗均开始出现大量白色根状突起，其中，G4和G6号培养基的苗根状突起最多，生根较早。第14天时，所有培养基中的苗都已生根，且根系粗壮。第16，18，21 天时，添加 NAA的 G4，G5，G6号培养基上试管苗的生根数明显多于添加IBA的G1，G2，G3号培养基。第27天时，测量根长发现，NAA和IBA质量浓度分别在 0.2，0.4 mg/L（G4和 G5，G1和G2）时，平均根长无显著差异。NAA的生根率显著高于IBA的生根率。G3号培养基IBA质量浓度达到0.6 mg/L时，根长显著增加。在NAA和IBA同时存在的G6号培养基上，根长且粗壮。从平均生根数来看，NAA质量浓度为0.4 mg/L时，平均生根数最高可达4.7条。由于后续过渡栽培成活率依赖于根数的多少、根长、根系粗壮度等综合指标，所以，“东方不败”的最佳生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖（或白糖）+6.5 g/L琼脂粉。

表6 “东方不败”在不同培养基、不同时间内的生根数及根长统计（70株）

2.4 苗的驯化与移栽

组培苗的过渡栽培环节是实现快繁的最后一个重要环节，其关键是保持介质的保水和透气性、保持较低的温度和较高的湿度。本试验在移栽管理过程中发现，首先要用0.1%多菌灵药水洗根，并在每周喷施1次0.1%的百菌清抑制杂菌；在介质的选择上，选用廉价的粗河沙并且配以每周1次的MS营养液补充；温度控制为24～28℃，相对湿度85%～90%，逐渐增加光照的条件下，移栽成活率均可达92%。

3 讨论

（1）本研究中，以子房作为外植体，取花蕾作为消毒材料，可有效降低初代接种培养的污染率，而且取材量大。这与王晓娟等[5]的研究结果相同。

（2）在6-BA为1～2 mg/L时，愈伤组织诱导率很低；随6-BA质量浓度升高到3～4 mg/L时，愈伤组织发生和生长较快，结构致密，色泽鲜黄。在光照条件下，伴随着愈伤组织的发生和生长，分化出大量不定芽。从不同品种大花萱草的研究来看，对6-BA质量浓度的要求存在很大差异[6-10]，所以，在研究大花萱草的组织培养技术时，应该有针对性地研究不同品种的激素水平和激素配比。

（3）在大花萱草“东方不败”的研究中，我们也发现，初代诱导愈伤组织时，愈伤组织的形成过程是先出现白色松软的愈伤组织，随着诱导时间的延长，愈伤组织变为浅黄色或黄色，致密颗粒状。但是，愈伤组织在继代分化培养时，不定芽的分化是伴随着愈伤组织的生长同时进行的，不存在愈伤组织全部分化不定芽和全部生长为愈伤组织的情况，这与王晓娟等[5]的研究结果相同。不定芽的分化率和愈伤组织生长量大小之间的调节主要靠细胞分裂素的浓度进行。

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