维生素K缺乏时鼠尿理化性质的改变与尿结石形成的关系

赵建军 陈鹏杰 杨海平 李 磊

(河北工程大学附属医院泌尿外科，河北 邯郸 056002)

尿结石的形成是一个复杂的物理化学过程，是一种世界范围的常见病和多发病，发病率呈上升趋势。尿结石的形成原因至今尚未完全清楚，一般认为它与尿液pH、尿道感染、矿物质代谢障碍等多种因素有关［1］。

尿结石的形成与尿液中大分子蛋白质的性质明显相关，如尿凝血片段 1(urinary prothrombin fragment 1，UDTF1)是抑制尿中草酸钙结晶的主要因子之一，是维生素K依赖性尿蛋白，其氨基末端的10～12个γ-羧基谷氨酸(Gla)残基是其强烈抑制草酸钙结晶的分子基础［2］。在以前的研究中，我们曾观察到应用维生素K拮抗剂-香豆素可以造成大鼠生成肾结石的倾向增加［3］。另外，我们对肾结石患者应用维生素K后其尿中抑制草酸钙结晶活性增加［4］，说明维生素K缺乏可能改变UDTF1分子氨基酸构成，与肾结石形成有关。但维生素K缺乏时尿液理化性质的变化，以及此变化与肾结石形成的关系，国内外尚未见相关报道，值得进一步研究。

在本实验中我们通过成功建立维生素K缺乏的实验动物模型，以期观察维生素K缺乏时大鼠尿液理化性质的变化，探讨此变化与肾结石形成的关系，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠40只(体质量180～220 g)，由哈尔滨医科大学第一临床医学院实验动物中心提供，动物合格证号:黑医动证字09-032号。饲养条件:温度为18～29℃，相对湿度40% ～70%，每h换气次数10～20次，噪声60 db以下。

1.1.2 药品 诱石剂饮水采用饮水中加0.6%乙二醇及0.6%氯化铵，均购于哈尔滨市试剂公司。维生素K1标准品(Sigma)。

1.2.3 饲料配方 采用AIN93M(the American Institute of Nutrition-for adult rat maintenance)饲料配方，各种饲料成分均购于哈尔滨市试剂公司。从中去除维生素K成分来制作无维生素K饲料。因豆油中含有维生素K，故本实验中采用玉米油代替。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及饲养 将实验动物随机分为4组，即对照组(A组)(含维生素K饲料和普通饮水)、无维生素K饲料组(B组)(无维生素K饲料和普通饮水)、诱石剂饮水组(C组)(含维生素K饲料和诱石剂饮水)、无维生素K饲料诱石剂饮水组(D组)(无维生素K饲料和诱石剂饮水)，每组10只。

1.2.2 大鼠尿液理化指标的测定 所用鼠尿为饲养第3周末开始代谢笼饲养，收集24 h尿，加1%叠氮钠4℃保存待用，共1周。应用PHS-2C型数字显示酸度计测定尿pH值，乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法测定尿钙量，变色酸比色法测定尿草酸含量。

1.2.3 高压液相法测定血浆中维生素K1水平 饲养4周后，水合氯醛腹腔注射麻醉，股动脉采血2 mL/只，低速离心(1 200 r/min)15 min，吸取血浆，立即避光封存于-70℃冰箱中。从-70℃冰箱中取出样品，待融化后，离心(3 500 r/min 10 min)，取上清液 0.5 mL 加甲醇 0.5 mL，混匀2 min，再加入5 mL正己烷混匀5 min，再次离心(3 500 r/min 5 min，离心后弃去己烷层，取甲醇层置于微量离心管中，最后离心(10 000 r/min 5 min)，取上清液通过进口一次性微量过滤器(0.22 μm)过滤，稀释10倍，取5 μL上机测样。整个过程较严格在避光条件中进行，稀释标准品浓度为 10 μg/mL=10 ng/μL。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。用单因素方差分析法进行组间差异显著性分析。

2 结果

2.1 各组血浆中维生素K1水平的比较 见表1。

表1 各组血浆中维生素K1水平的比较 nmoL/L

由表1可见，大鼠血浆中维生素K1的水平无维生素K饲料组明显低于对照组(P＜0.001)，无维生素K饲料诱石剂饮水组明显低于诱石剂饮水组(P＜0.001)。

2.2 各组尿量、尿钙、尿草酸及尿pH比较 见表2。

表2 各组尿量、尿钙、尿草酸及尿pH比较

表2 各组尿量、尿钙、尿草酸及尿pH比较

与 A 组比较，*P ＜0.005，＊＊ P ＜0.001

组 别 尿量(mL/24 h)尿钙(mmoL/24 h)尿草酸(mmoL/24 h) 尿pH A组22.72 ±1.89 1.52 ±0.15 15.05 ±1.54 7.93 ±0.35 B 组 44.23 ±4.85＊＊ 2.36 ±0.21＊＊ 19.73 ±1.27* 6.32 ±0.11*C 组 13.63 ±0.94＊＊ 2.66 ±0.13＊＊ 23.53 ±1.13* 5.65 ±0.23*D 组 13.69 ±1.44＊＊ 2.71 ±0.38＊＊ 26.99 ±1.51* 5.21 ±0.27*

由表2可见，无维生素K饲料组24 h尿量较对照组明显增加(P＜0.001)，诱石剂饮水组和无维生素K饲料诱石剂饮水组与对照组相比明显减少(P＜0.001);鼠尿中24 h尿钙排出量无维生素K饲料组、无维生素K饲料诱石剂饮水组及诱石剂饮水组与对照组相比均明显增加(P＜0.001);鼠尿中24 h尿草酸排出量无维生素K饲料组、诱石剂饮水组及无维生素K饲料诱石剂饮水组与对照组比较明显增加(P＜0.005);大鼠尿pH值无维生素K饲料组、诱石剂饮水组及无维生素K饲料诱石剂饮水组与对照组比较均降低(P＜0.005)，显示无维生素K饲料组、诱石剂饮水组及无维生素K饲料诱石剂饮水组3组尿液均酸化，且程度按无维生素K饲料组→诱石剂饮水组→无维生素K饲料诱石剂饮水组依次逐渐加重。

3 讨论

本次实验采用美国营养学会AIN-93M实验性大鼠的饲料配方，从中去除维生素K成分，并且将饲料配方中的豆油用玉米油代替，因豆油含有维生素K成分，限制外源性维生素K的摄入，并且辅以每日2次清除大鼠粪便加上大鼠尾部粪套方法，限制内源性维生素K合成。造成维生素K缺乏模型，并通过高压液相检验血浆中的维生素K1水平来证实。

维生素K缺乏时，大鼠的尿量明显增加，提示肾小管的重吸收功能减弱，间接提示肾小管的受损。在同样应用诱石剂的情况下，2组实验大鼠的尿量无差别，但较正常对照组明显减少，提示在诱石剂喂养下造成肾小管的重度损伤。

尿钙是仅次于草酸的一种重要的成石因子，正常饮水时维生素K缺乏组，大鼠尿钙的排出量增加显著，结果提示:第一，维生素K参与全身钙代谢，缺乏时全身骨脱钙，但脱钙的后果是尿中钙浓度的升高，尿中钙排泄的增加却是造成肾结石形成的一个重要因素;第二，当维生素K缺乏时，全身的羧化水平降低，造成依赖维生素K羧化的尿蛋白结构和功能的异常，进而造成尿液中晶体对肾小管上皮的损伤，损伤后钙的回吸收减少。两者结合更易导致晶体对肾小管的损害与黏附，从而形成结石。当给予诱石剂饮水时，2组大鼠尿钙的排出量无差别。但与正常组比较尿钙的排出量显著增加，说明钙代谢的极度异常。

尿草酸是非常重要的成石因子，其成石作用是尿钙的10倍，所以尿中草酸浓度的增加对于草酸钙结石的形成具有重要意义［5-6］。本实验发现在正常饮水的情况下，缺乏维生素K的实验组，草酸的排出量明显高于对照组，草酸的排出增加。在同时诱石剂饮水情况下，缺乏维生素K组草酸的排出量高于无缺乏组，进一步说明维生素K存在情况下，肾小管的上皮组织有自然的保护机制，在同样的诱石剂损伤因子存在时，正常饮食的大鼠肾小管受损较轻。

缺乏维生素K的实验组尿pH值低于对照组。诱石剂饮水的实验组，维生素K缺乏与否，其pH值的差异同样显著。酸性尿有利于结石的形成，缺乏维生素K时，尿的酸性加强，说明此时有利于结石的形成

本实验发现维生素K缺乏时鼠尿理化性质的变化有着明显的结石形成倾向，可能是由于依赖维生素K尿蛋白分子结构的异常所致，尿蛋白分子结构异常与鼠尿理化性质的变化可能存在一定的相关性。

［1］Robertson WG，Jones JS，Heaton MA，et al.Predicting the crystallization potential of urine form cats and dogs with respect to calcium oxalate and magnesium ammonium phosphate(struvite)［J］.The journal of Nutrition Bethesda，2002，132(6S):1637-1641.

［2］陈俊汇，刘继红，章咏裳，等.草酸钙尿结石患者肾组织维生素K依赖羧化酶活性的研究［J］.中华泌尿外科杂志，2002，23(12):725-727.

［3］安瑞华，冯陶，沈绍基，等.香豆素对实验性大鼠草酸钙结石形成的影响［J］.中华泌尿外科杂志，1994，15(3):209-212.

［4］安瑞华，李勇强，祁尤成，等.维生素K对肾结石患者尿抑制作用的影响［J］.中华泌尿外科杂志，1998，19(8):460-462.

［5］Smith LH.Diet and hyperoxaluria in the syndrome of idiopathic calcium oxalate urolithiasis［J］.Am J Kidney Dis，1991，17(4):370-375.

［6］Sigmon D，Kumar S，Carpenter B，et al.Oxalate transport in renal tubular cells from normal and stone-forming animals［J］.Am J Kidney Dis，1991，17(4):376-380.