mdr1及P-gp与脑胶质瘤耐药关系的研究

付旭东 张艳艳 王新军 寿记新 宋来君

恶性胶质瘤患者平均生存期较短，通常手术切除肿瘤组织并不能从根本上延长患者的生存时间，而且应用药物化疗易产生多药耐药性（multidrug resistance,MDR），使化疗失败。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）介导的药物外排是产生MDR的主要机制，其编码基因分别为mdr1和mrp1。本研究以耐阿霉素(Dox)的人脑胶质瘤细胞系U251为研究对象，观察mdr1对脑胶质瘤细胞MDR形成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人脑胶质瘤细胞系U251购自上海复蒙基因生物科技有限公司。参考刘福生等[1]的方法，本实验室利用Dox自行诱导U251耐药细胞（U251/Dox），取对数生长期U251细胞在37℃，饱和湿度及5%CO2的培养箱内培养于低浓度Dox（0.001、0.01、0.1、0.25、0.5 mg/L，4周内提高药物浓度），在细胞传代过程中相互结合，4个月后将细胞培养于含0.5 mg/LDox和10%FBS的1640培养液中，3～4 d传一代；在无Dox的细胞培养液中耐药性不变，说明已有稳定的耐药性。实验时取对数生长期细胞。Rh123（美国Sigma公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），RT-PCR两步法试剂盒（TaKaRa公司），引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，免疫组化SP试剂盒及兔抗人P-gp单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 流式细胞术检测Rh123蓄积与泵出试验 Rh123蓄积试验：取对数生长期U251和U251/Dox细胞，稀释到1×106个/ mL，接种于6孔板，3个复孔，Rh123终浓度1 mg/L，37℃，5% CO2孵育60 min，冷PBS洗2次，立即检测细胞的平均荧光强度(MFI)。Rh123泵出试验：细胞收集处理方法同上；37℃，5%CO2孵育60 min，冷PBS洗2次，然后检测MFI(0 min泵出)；余液同时置于PBS溶液中，于60 min后，冷PBS洗2次并检测MFI(60 min泵出)。Rh123细胞泵出率=（1-60 min MFI/ 0 min MFI）×100%。

1.3 U251及U251/Dox细胞mdr1 mRNA表达 取对数生长期的U251及U251/Dox细胞，总RNA提取和RT-PCR按Trizol和TaKaRa试剂盒操作。引物：β-actin上游5′-ATA TCG CTG CGC TGG TCG TC-3′，下游5′-AGG ATG GCG TGA GGG AGA GC-3′，产物517 bp；mdr1上游5′-CCA TCA TTG C AA TAG CAG G-3′，下游5′-AGT CCT CGT CTT CAA ACT TG-3′，产物157 bp。PCR循环为94℃预变性1 min，然后30 s，55℃1 min，72℃1 min，30个循环，72℃延伸7 min。PCR产物分析采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，BIORAD Quantity One 4.2凝胶图像分析系统。计算方法：目的基因条带灰度相对值=（目的基因条带灰度值-背景灰度值)/(内参基因条带灰度值-背景灰度值）。

1.4 P-gp表达 采用免疫组织化学法，细胞培养片经4%多聚甲醛固定，加入兔抗人P-gp单克隆抗体(1∶300)。判断标准：细胞浆及细胞膜上有棕黄色颗粒的为阳性细胞。每例均随机观察8个高倍视野，读取阳性细胞数。

1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0软件进行数据分析，各组计量数据用均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U251、U251/Dox细胞对Rh123蓄积与泵出能力 Rh123的蓄积试验显示，60 min时，U251细胞较U251/Dox细胞内药物蓄积显著增加(MFI分别为375.31±13.53和168.00±18.03，t=15.93，P＜0.05)。U251/Dox细胞内药物泵出率高，细胞内药物明显减少，见表1。

表1 U251、U251/Dox细胞对Rh123泵出能力(n=6，±s)

表1 U251、U251/Dox细胞对Rh123泵出能力(n=6，±s)

＊P＜0.05

组别MFI 0 min 60 min泵出率（%）U251 U251/Dox t 16.67±1.53 51.00±3.61 15.19＊216.56±1.44 197.44±7.48 4.35＊180.26±4.67 96.79±10.04 13.06＊

2.2 mdr1 mRNA的表达水平 U251/Dox细胞mdr1电泳条带较亮、产量高，其灰度值较U251细胞灰度值增高，见表2。

表2 mdr1 mRNA及P-gp表达情况（n=6，±s）

表2 mdr1 mRNA及P-gp表达情况（n=6，±s）

＊P＜0.05

组别 mdr1 mRNA P-gp U251 U251/Dox t 135.78±13.09 210.32±7.85 8.46＊0.32±0.11 0.72±0.13 4.21＊

2.3 P-gp蛋白表达情况 U251细胞中P-gp弱阳性表达；U251/Dox细胞P-gp阳性表达，较U251细胞明显增强，见表2。

3 讨论

目前临床对脑胶质瘤的治疗是以手术及术后的放、化疗为主要手段。大多数脑胶质瘤对放疗敏感性较低，化疗是胶质瘤术后的重要手段，但效果一直很不理想，除了存在血脑屏障影响之外，肿瘤细胞对化疗药物的耐受也是重要原因。MDR是肿瘤细胞对结构各异、作用机制不相同的多种化疗药物交叉耐药，是肿瘤细胞免受化疗药物攻击最重要的细胞防御机制，同时也是临床上造成化疗失败、肿瘤复发率增高的主要原因之一。

人脑胶质瘤耐药现象的发生与多种基因及其产物异常有关，包括MDR、MRP及肺耐药相关蛋白(lung resistance-re⁃lated protein,LRP)等。人类基因中MDR含有2个基因mdr1和mdr2，其中mdr1基因与一些肿瘤耐药有关[2]。P-gp为mdr1基因表达产物，是一种ATP依赖性转运蛋白，分子质量为170 ku，其与抗肿瘤药物结合后通过ATP提供的能量，将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度下降，而产生耐药现象[3-5]。

本实验以人脑胶质瘤细胞系U251在体外经过Dox多次筛选传代建立U251/Dox耐药模型。Rh123是一种疏水性荧光染料，可被激发出红色荧光，易于用流式细胞仪测定,同时其化学结构与很多抗癌药物相似，是特异性较强的P-糖蛋白的底物，可有效地被表达P-gp的细胞排出胞外，对细胞毒性低，Rh123常用于替代抗癌药物测定药物在胞内的蓄积情况。从Rh123泵出试验结果，可看出U251/Dox细胞泵出率明显高于U251细胞。同时RT-PCR及免疫组化结果显示，在U251/Dox细胞中mdr1 mRNA和P-gp蛋白表达均高于U251细胞。

本研究结果显示，脑胶质瘤细胞多药耐药产生与mdr1过度表达和影响P-gp功能使细胞内药物蓄积减少、泵出增加有关，与之前文献报道的蒽环类抗生素、铂类等抗肿瘤药物产生耐药性机制的研究结果一致[6]。

[1]刘福生，张庆林，赵丽，等.胶质瘤多药耐药细胞系C6/adr的建立及其耐药性逆转的研究[J].中华神经外科杂志，2001，17(2)：109-112.

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[3]潘强，杨学军.胶质瘤化疗药物耐药性分子机制的研究[J].中国临床神经外科杂志，2010，15(2)：118-122.

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[6]Triller N,Korosec P,Kern I,et al.Multidrug resistance in small cell lung cancer:expression of P-glycoprotein,multidrug resistance protein 1 and lung resistance protein in chemo-naive patients and in relapsed disease[J].Lung Cancer,2006,54(2):235-240.